JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 2:43 Min. • April 30th, 2023
Die formalinfixierte Paraffineinbettungs- oder FFPE-Technik ermöglicht die Konservierung von fixierten, dehydrierten und geklärten Gewebeproben in Paraffinblöcken für die Langzeitlagerung. FFPE bewahrt Proteine und andere lebenswichtige intrazelluläre Bestandteile, ohne die Gewebemorphologie zu beeinträchtigen.
Die Entparaffinisierung oder die Entfernung von Paraffinwachs, das das eingebettete Gewebe umgibt, ist ein kritischer Schritt vor der Verarbeitung von FFPE-Gewebeproben für die nachgelagerte Analyse. Um mit der Entparaffinierung zu beginnen, beginnen Sie mit einem Objektträger mit einem ungefärbten FFPE-Gewebeschnitt von Interesse mit einer angemessenen Dicke.
Tauchen Sie den Gewebeschnitt in ein Xylolbad und inkubieren Sie ihn für die gewünschte Dauer. Xylol, ein organisches Lösungsmittel, löst das Paraffinwachs auf, das sich in das Gewebe eingenistet und eingedrungen ist. Durch die vollständige Entfernung von Paraffinwachs wird die fixierte und dehydrierte transparente Gewebeprobe freigelegt.
Nach der Entparaffinierung ist die Probe mit absolutem Ethanol zu behandeln. Ethanol verdrängt und entfernt alle Spuren von Xylol aus dem Gewebeschnitt. Tauchen Sie anschließend das Gewebe in abnehmende Ethanolkonzentrationen. Das Verfahren rehydriert das Gewebe für die nachgelagerte histologische Analyse.
Lassen Sie die Rutsche abschließend für die gewünschte Dauer ungestört. Dieser Schritt ermöglicht das Verdampfen von Ethanol und Wasser und erhält einen trockenen, rehydrierten Gewebeschnitt.
Bereiten Sie zunächst 10 Mikrometer ungefärbter, formalinfixierter, in Paraffin eingebetteter Abschnitte vor. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerhalter aus Glas und füllen Sie ihn mit Xylol, wobei Sie darauf achten, dass das gesamte Gewebe auf dem Objektträger untergetaucht ist. Lassen Sie die Objektträger 15 Minuten lang in Xylol. Gießen Sie dann das Xylol aus, während Sie die Objektträger mit einer Pipettenspitze festhalten, damit sie nicht herausfallen. Gießen Sie mehr Xylol auf den gleichen Stand wie zuvor ein und wiederholen Sie die Inkubation.
Gießen Sie das Xylol aus und füllen Sie den Objektträgerhalter mit 100% Ethanol, wobei Sie darauf achten, dass das gesamte Gewebe auf dem Objektträger vollständig untergetaucht ist. Lassen Sie die Objektträger 3 Minuten im Ethanol. Ersetzen Sie dann das Ethanol durch frisches Ethanol und lassen Sie sie weitere zwei Minuten inkubieren. Gießen Sie das Ethanol ab und entfernen Sie die Objektträger. Legen Sie sie vorsichtig mit der Vorderseite nach oben auf ein sauberes Papiertuch und lassen Sie sie 10 Minuten trocknen.