Bisulfit-Umwandlung genomischer DNA: Eine Methode zur Untersuchung der DNA-Methylierung in genomischen DNA-Proben aus gastrointestinalem Krebsgewebe

Bei der DNA-Methylierung wird die Methylgruppe an Cytosinreste der DNA angehängt, um Methyl-Cytosin zu bilden, was zu einer DNA-Veränderung und Genexpressionsregulation führt.

Um die DNA-Methylierung zu untersuchen, beginnen Sie mit der Einnahme von rohem DNA-Extrakt aus Krebszellen. Fügen Sie einen Verdünnungspuffer hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur. Der Puffer verdünnt das Gemisch und denaturiert die doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA, wodurch die Zugänglichkeit von Basen für nachfolgende Reaktionen begünstigt wird.

Fügen Sie ein Konversionsreagenz hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln. Natriumbisulfit im Reagenz löst die Sulfonierung und anschließende Desaminierung von unmethylierten Cytosinresten aus, was zur Bildung von Uracil-Sulfonat führt. Die methylierten Cytosin-Rückstände bleiben jedoch unverändert.

Ergänzen Sie anschließend die DNA mit einem Bindungspuffer und überführen Sie sie in eine vormontierte Spin-Filter-Säule. Der Puffer hilft der DNA, sich an den Filter zu binden.

Zentrifugieren Sie, um die Mischung aus Puffer und Bisulfit-Reagenzien aus der eingeschlossenen DNA in der Säule zu entfernen. Verwerfen Sie den Durchfluss. Fügen Sie der DNA einen alkalischen Desulfonierpuffer hinzu. Der Puffer hilft bei der Entfernung der Sulfitgruppe aus Uracil-Sulfonat zur Bildung von Uracil.

Zentrifugieren, um den verbrauchten Puffer zu entfernen. Fügen Sie nun der Säule einen Elutionspuffer hinzu, um die umgewandelte DNA zu eluieren. Führen Sie eine PCR durch, um die DNA zu amplifizieren. Alle umgewandelten Uracilreste amplifizieren sich als Thymine, während die methylierten Cytosinreste als Cytosine amplifizieren.

Sequenzieren Sie Cytosinreste der amplifizierten DNA, um ein Methylierungsprofil der Probe zu erstellen.

Führen Sie die Bisulfit-Behandlung an 45 Mikrolitern des verdauten Gewebes mit einem Bisulfit-Umrüstkit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Geben Sie 5 Mikroliter Verdünnungspuffer in die Probe und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie in der Zwischenzeit das Bisulfit-Umwandlungsreagenz vor, indem Sie 750 Mikroliter destilliertes Wasser und 210 Mikroliter Verdünnungspuffer in ein Röhrchen CT-Umwandlungsreagenz geben. Mischen Sie die Röhren, indem Sie sie 10 Minuten lang vortexen. Geben Sie dann 100 Mikroliter des vorbereiteten CT-Umwandlungsreagenzes zu jeder Probe und mischen Sie es durch Inversion.

Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei 50 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden. Legen Sie die Proben nach der Inkubation 10 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie 400 Mikroliter Bindungspuffer hinzu und mischen Sie jede Probe durch Auf- und Abpipettieren. Laden Sie jede Probe in eine Spin-Säule und legen Sie die Säule in ein 2-Milliliter-Sammelröhrchen. Zentrifugieren Sie die Proben 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit und verwerfen Sie den Durchfluss. Geben Sie 200 Mikroliter Waschpuffer in jede Säule und schleudern Sie 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit, dann entsorgen Sie den Durchfluss.

Geben Sie 200 Mikroliter Desulfonierungspuffer in jede Säule und lassen Sie die Säulen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Nach der Inkubation drehen Sie die Säulen 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit und verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule zweimal mit 200 Mikrolitern Waschpuffer und zentrifugieren Sie sie nach jedem Waschgang 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit.

Geben Sie 46 Mikroliter destilliertes Wasser in jede Säule und geben Sie es in ein neues steriles 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen aus Polypropylen. Drehen Sie die Röhrchen 2 Minuten lang, um die DNA zu eluieren und die Säule zu entsorgen. Die DNA ist nun bereit für die Analyse. Verwenden Sie die Bisulfit-modifizierte DNA als Vorlage für die quantitative methylierungsspezifische PCR, um die Methylierung der Promotorregion in jeder Genanalyse zu bewerten. Kombinieren Sie die Reagenzien wie im Textmanuskript beschrieben, und verwenden Sie ein 96-Well-Echtzeit-PCR-Instrument, um das Temperaturwechselprotokoll auszuführen.