Bisulfit-Umwandlung genomischer DNA: Eine Methode zur Untersuchung der DNA-Methylierung in genomischen DNA-Proben aus gastrointestinalem Krebsgewebe

Bei der DNA-Methylierung wird die Methylgruppe an Cytosinreste der DNA angehängt, um Methyl-Cytosin zu bilden, was zu einer DNA-Veränderung und Genexpressionsregulation führt.

Um die DNA-Methylierung zu untersuchen, beginnen Sie mit der Einnahme von rohem DNA-Extrakt aus Krebszellen. Fügen Sie einen Verdünnungspuffer hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur. Der Puffer verdünnt das Gemisch und denaturiert die doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA, wodurch die Zugänglichkeit von Basen für nachfolgende Reaktionen begünstigt wird.

Fügen Sie ein Konversionsreagenz hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln. Natriumbisulfit im Reagenz löst die Sulfonierung und anschließende Desaminierung von unmethylierten Cytosinresten aus, was zur Bildung von Uracil-Sulfonat führt. Die methylierten Cytosin-Rückstände bleiben jedoch unverändert.

Ergänzen Sie anschließend die DNA mit einem Bindungspuffer und überführen Sie sie in eine vormontierte Spin-Filter-Säule. Der Puffer hilft der DNA, sich an den Filter zu binden.

Zentrifugieren Sie, um die Mischung aus Puffer und Bisulfit-Reagenzien aus der eingeschlossenen DNA in der Säule zu entfernen. Verwerfen Sie den Durchfluss. Fügen Sie der DNA einen alk