Peritoneale Isolierung von Neutrophilen niedriger Dichte: Eine Technik zur Gewinnung von Neutrophilen niedriger Dichte aus Peritonealspülflüssigkeit unter Verwendung von magnetisch aktivierter Zellsortierung

Neutrophile mit niedriger Dichte (LDNs) sind eine eigenständige neutrophile Subpopulation, die bei pathologischen Zuständen wie Magen-Darm-Krebs in erhöhter Zahl vorkommt. LDNs können aus den Waschungen der Bauchhöhle oder der Spülflüssigkeit von Patienten isoliert werden.

Filtern Sie zunächst die Spülflüssigkeit, um Gewebereste zu entfernen. Das Filtrat wird zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten, das Blutzellen, einschließlich LDNs, enthält. Es wird in einem geeigneten Puffer resuspendiert. Schichten Sie diese Suspension über ein geeignetes Dichtegradientenmedium, das optimal für die LDN-Isolierung ist.

Zentrifuge, um die verschiedenen Blutbestandteile anhand ihrer relativen Dichte zu trennen. Die dichteren Erythrozyten bilden die unterste Schicht, während die am wenigsten dichte Plasmafraktion die oberste Schicht bildet. Die weniger dichten LDNs besetzen die Zwischenschicht zusammen mit anderen mononukleären Zellen.

Übertragen Sie die Zwischenschicht in ein frisches Röhrchen, das ein Blockierungsreagenz enthält. Die Reagenzkomponenten blockieren unspezifische Bindungsstellen auf den Oberflächen aller Nicht-Zielzellen und erhöhen die Spezifität für LDN bei der anschließenden Markierung.

Fügen Sie Antikörper-konjugierte Mikrokügelchen hinzu, die auf ein bestimmtes Zelloberflächenmolekül abzielen, das auf LDNs überexprimiert ist. Inkubieren Sie, damit die Antikörper-Bead-Komplexe an ihre Zielmoleküle auf LDNs binden können.

Führen Sie die inkubierte Suspension durch eine Säule, die in einem Magnetfeld platziert ist. Unter dem magnetischen Einfluss haften alle LDN-Mikrokügelchen-Komplexe an der Säulenwand, während unmarkierte Zellen hindurchgehen.

Entfernen Sie die Spalte. Spülen Sie den Inhalt mit einem geeigneten Puffer, um die LDN-haltige Fraktion zu eluieren und aufzufangen.

Um die Neutrophilen zu gewinnen, infundieren Sie zunächst unmittelbar vor dem Wundverschluss 1 Liter normale sterile Kochsalzlösung direkt in die Bauchhöhle eines Patienten, der sich gerade einer Bauchoperation aufgrund eines gastrointestinalen Malignitäts unterzogen hat, und spülen Sie die Bauchhöhle mindestens 1 Minute lang großflächig. Rühren Sie dann die Kochsalzlösung in der Kavität und gewinnen Sie mit vier 50-Milliliter-Spritzen 200 Milliliter Spülflüssigkeit zurück.

Im Labor wird die Peritonealspülflüssigkeit durch einen 100-Mikrometer-Nylonfilter in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen zur Zentrifugation geleitet. Resuspendieren Sie die Pellets in 5 Millilitern PBS, ergänzt mit 0,02 % EDTA, und überlagern Sie jede Zellsuspension vorsichtig mit 3 Millilitern Dichtegradientenlösung. Nach der Trennung des Dichtegradienten ernten Sie 2 bis 3 Milliliter der Zwischenschicht aus jedem Röhrchen und waschen Sie die Peritonealflüssigkeitsproben in 10 Millilitern frischem PBS plus EDTA pro Röhrchen. Gießen Sie die Pellets für eine zusätzliche Wäsche in 10 Milliliter frisches PBS plus EDTA und verdünnen Sie die Zellen auf eine 1 mal 10 bis siebte Zellen pro 60 Mikrometer magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) Pufferkonzentration.

Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 20 Mikrolitern Fc-Block für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, gefolgt von der Zugabe von 20 Mikrolitern magnetischen Anti-CD66b-Kügelchen. Nach 10 Minuten bei 4 Grad Celsius waschen und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern MACS-Puffer und geben Sie die Zellen in eine Magnetsäule geeigneter Größe innerhalb des Magnetfeldes eines geeigneten Magnetseparators. Wenn alle CD66b-negativen Zellen die Säule durchlaufen haben, geben Sie 15 Milliliter frischen MACS-Puffer in das Säulenreservoir und überführen Sie die Säule aus dem Magnetabscheider in ein neues konisches Röhrchen. Tauchen Sie dann sofort die Säule ein, um das magnetisch markierte CD66b-Plus in die Röhre zu spülen.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.