Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von neutrophilen extrazellulären Fallen oder NETs: Eine Technik zur Analyse der Postadhäsionsinteraktion zwischen Krebszellen und NETs

Bei pathologischen Zuständen wie Krebs setzen aktivierte Neutrophile extrazelluläre Fallen oder NETs frei - ein Netzwerk extrazellulärer DNA-Fasern, die mit Histonen und proteolytischen Enzymen assoziiert sind. Diese Strukturen schließen Krebszellen ein und spielen eine Schlüsselrolle bei der Metastasierung von Krebs.

Um das Postadhäsionsverhalten von eingeschlossenen Krebszellen in NETs in vitro zu untersuchen, kultivierte man zunächst Neutrophile mit niedriger Dichte - eine neutrophile Subpopulation - in einer polymerbeschichteten Kulturschale, die die Zellanheftung erleichtert. Inkubieren, um die Neutrophilen zu aktivieren und netzartige NETs freizusetzen.

Fügen Sie als Nächstes einen membranundurchlässigen, grün fluoreszierenden Kernfarbstoff hinzu, um die DNA-Fasern in NETs spezifisch zu färben. Entfernen Sie das verbrauchte Medium. Geben Sie eine Suspension von Krebszellen in die Neutrophilenkultur.

Inkubieren Sie die Kultur für einen kurzen Zeitraum, um die Interaktion zwischen Krebszellen und -NET zu erleichtern. Die DNA-Komponente von NETs fungiert als chemotaktischer Faktor, der die Migration von Krebszellen stimuliert und deren Adhäsion an NETs unterstützt.

Entfernen Sie das verbrauchte Medium. Spülen Sie die Kultur vorsichtig mit geeigneten frischen Medien aus, um ungebundene Krebszellen aus der Kulturschale zu entfernen. Mit einem frischen serumhaltigen Medium auffüllen.

Bilde die Kultur über einen längeren Zeitraum mit Hilfe von Zeitraffer-Videomikroskopie ab, um die interaktiven Ereignisse zwischen NETs und Krebszellen zu analysieren. Im Laufe der Zeit bieten die NETs eine geeignete Mikroumgebung, die die Vermehrung von Krebszellen erleichtert. Verwenden Sie geeignete Software, um die Vermehrung von Krebszellen auf grün fluoreszierenden NETs zu beobachten.

Kultivieren und färben Sie die peritonealen Neutrophilen niedriger Dichte in einer 35-Millimeter-Schale, die mit Poly-L-Lysin beschichtet ist, wie gezeigt, gefolgt von einer kurzen Wäsche in 2 Millilitern mit 0,1 % BSA plus RPMI 1640.

Ersetzen Sie das Medium durch 1 mal 10 bis sechste ungefärbte Magentumorzellen, die in 2 Millilitern RPMI suspendiert sind, ergänzt mit BSA, für eine 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen am Ende der Inkubation 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 Millilitern frischem RPMI, das mit BSA angereichert ist, und schwenken Sie sie anschließend leicht, um nicht anhaftende Tumorzellen zu entfernen.

Ersetzen Sie dann den Überstand durch DMEM, das mit FBS und Antibiotika ergänzt wird, und montieren Sie die Schale in ein Ganzansichts-Zellbeobachtungssystem für die Zeitrafferanalyse der Tumorzellfalle durch die NETs.