Präparation von Exosomenblöcken: Ein Protokoll zur Konservierung von Exosomen aus kultivierten menschlichen Darmkrebszellen

Exosomen sind die extrazellulären vesikulären Strukturen, die von kultivierten Zellen in den Überstand sezerniert werden. Um einen Exosomenblock herzustellen, beginnen Sie mit der Entnahme eines Exosomen-haltigen Kulturüberstands in einem Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit, um die intakten Exosomen zu pelletieren. Den restlichen Überstand verwerfen.

Behandeln Sie das Exosom-Pellet mit Glutaraldehyd, das im Fixierpuffer enthalten ist. Inkubieren Sie die Mischung für die gewünschte Zeit auf Eis, um die Morphologie der Exosomen zu erhalten. Glutaraldehyd infiltriert die Exosomen und vernetzt die Proteine. Der Fixierpuffer hält die Exosomen für den nachgeschalteten Fixierungsprozess auf einem neutralen pH-Wert.

Verwerfen Sie den Glutaraldehyd-haltigen Puffer und fügen Sie Osmiumtetroxidlösung hinzu - ein sekundäres Fixiermittel, das die Membrandoppelschicht permeabilisiert und die in Exosomen vorhandenen Lipide fixiert. Entfernen Sie die Osmiumtetroxidlösung und behandeln Sie die Exosomen mit einer Reihe von steigenden Konzentrationen von Aceton. Dieser Prozess dehydriert die Exosomen.

Ersetzen Sie absolutes Aceton durch das einbettende Medium-Aceton-Ge