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Krebsforschung
0 Aufrufe • 3:43 Min. • April 30th, 2023
Exosomen sind die extrazellulären vesikulären Strukturen, die von kultivierten Zellen in den Überstand sezerniert werden. Um einen Exosomenblock herzustellen, beginnen Sie mit der Entnahme eines Exosomen-haltigen Kulturüberstands in einem Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit, um die intakten Exosomen zu pelletieren. Den restlichen Überstand verwerfen.
Behandeln Sie das Exosom-Pellet mit Glutaraldehyd, das im Fixierpuffer enthalten ist. Inkubieren Sie die Mischung für die gewünschte Zeit auf Eis, um die Morphologie der Exosomen zu erhalten. Glutaraldehyd infiltriert die Exosomen und vernetzt die Proteine. Der Fixierpuffer hält die Exosomen für den nachgeschalteten Fixierungsprozess auf einem neutralen pH-Wert.
Verwerfen Sie den Glutaraldehyd-haltigen Puffer und fügen Sie Osmiumtetroxidlösung hinzu - ein sekundäres Fixiermittel, das die Membrandoppelschicht permeabilisiert und die in Exosomen vorhandenen Lipide fixiert. Entfernen Sie die Osmiumtetroxidlösung und behandeln Sie die Exosomen mit einer Reihe von steigenden Konzentrationen von Aceton. Dieser Prozess dehydriert die Exosomen.
Ersetzen Sie absolutes Aceton durch das einbettende Medium-Aceton-Gemisch. Erhöhen Sie allmählich den Anteil des Einbettmediums in dieser Mischung.
Gießen Sie die Einbettungsmischung mit den Exosomen in die gewünschten Formen. Trocknen Sie die Formen bei hoher Temperatur im Ofen. Dies führt zu einer Polymerisation des Einbettungsmediums um die Exosomen, wodurch Blockaden entstehen.
Um das gereinigte Exosomenpellet zu fixieren, fügen Sie 1 Milliliter 2,5 % Glutaraldehyd in einer 0,1 M Natriumcacodylatlösung bei einem pH-Wert von 7,0 hinzu. Inkubieren Sie die Vesikel der Lipiddoppelschicht 1 Stunde lang bei 4 Grad Celsius. Entfernen Sie anschließend das Fixiermittel und spülen Sie die Pellets 10 Minuten lang mit 1 Milliliter einer 0,1 M Natriumcacodylat-Pufferlösung bei Raumtemperatur aus.
Fixieren Sie die Proben dann 1 Stunde lang bei 4 Grad Celsius mit 1 Milliliter 2 % Osmiumtetroxid. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie das Exosomenpellet dreimal mit dem 0,1 M Natriumcacodylatpuffer aus, wobei Sie den Puffer alle 10 Minuten wechseln. Dehydrieren Sie dann die Probe, indem Sie sie jeweils 10 Minuten lang in einer Reihe von abgestuften Acetonkonzentrationen schütteln.
Mischen Sie als nächstes eine Lösung aus drei Teilen Aceton und einem Teil niedrigviskoser Einbettungsmischung. Ersetzen Sie das Aceton durch diese Mischung und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang. Erhöhen Sie das Verhältnis des niedrigviskosen Einbettmediums weiter und inkubieren Sie bei jedem Schritt 30 Minuten lang.
Zum Schluss wird das Exosom-Pellet in 100 % des niedrigviskosen Einbettungsgemisches über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag betten Sie die Probe mit einer Einbettungsform in eine reine Einbettmischung mit niedriger Viskosität ein und backen Sie sie 24 Stunden lang bei 65 Grad Celsius.