Negative Färbung von gereinigten Exosomen: Ein Verfahren zur Visualisierung der Exosomenmorphologie mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Um eine negative Färbung von Exosomen - nanosierten, kugelförmigen Vesikeln - durchzuführen, beginnen Sie mit der Verwendung eines geeigneten Elektronenmikroskopiegitters. Bereiten Sie das Gitter mit einem Glühentlader vor. Dieser Prozess macht die Gitteroberfläche hydrophil für eine bessere Haftung der Proben.

Nehmen Sie gleichzeitig eine Suspension der gereinigten Exosomen in ein Röhrchen. Ergänzen Sie das Röhrchen mit Paraformaldehyd - einem Probenfixiermittel - und inkubieren Sie. Paraformaldehyd dringt in die Exosomen ein und vernetzt die Proteine und Nukleinsäuren. Dieser Schritt ist wichtig, um die Morphologie von Exosomen zu erhalten.

Laden Sie nun die Exosomensuspension auf das vorbereitete Gitter und inkubieren Sie, damit die Adsorption stattfinden kann. Geben Sie als Nächstes ein paar Tropfen Uranylacetat, einen Schwermetallfleck, über das Gitter. Uranyl-Ionen binden an die Membranproteine und Lipide und bilden eine Ablagerung um die Exosomengrenze.

Waschen Sie zuletzt das Gitter mit Wasser, um den überschüssigen Fleck zu entfernen. Lassen Sie das Gitter trocknen und bilden Sie es mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ab.

Wenn ein Elektronenstrahl auf die Exosomen trifft, streut der Fleck, der die Probe umgibt, mehr Elektronen. Exosomen, die weniger elektronendicht sind, lassen den Strahl durch. Diese unterschiedlich gestreuten Elektronen werden vom abbildenden System eingefangen, um ein kontrastreiches Bild zu erzeugen.

Negativ gefärbte Exosomen erscheinen heller, mit einer dunklen Grenze um sie herum.

Um eine negative Färbung durchzuführen, fixieren Sie die gereinigten Exosomen nach der Isolierung mit 1 Milliliter 2% Paraformaldehyd für 5 Minuten. Dünne Formvar/Carbonfilm-beschichtete 200 Mesh Kupfer EM-Gitter 1 Minute lang mit Glimmentladung behandeln. Laden Sie dann 5 bis 7 Mikroliter der Exosom-Suspensionslösung auf ein Gitter und inkubieren Sie es 1 Minute lang. Wenn die Konzentration des Exosoms zu hoch ist, verdünnen Sie die Konzentration auf ein geeignetes Niveau.

Färben Sie die Exosomen sofort mit etwa 20 Tropfen einer gefilterten 1%igen Uranylacetatlösung auf der Oberfläche des EM-Gitters. Entfernen Sie die überschüssige Uranylacetatlösung vom Gitter, indem Sie den Rand des Gitters mit Filterpapier berühren. Spülen Sie dann den Rost schnell mit einem Tropfen Wasser ab.

Lege den Rost mit einer Pinzette auf den Tisch und bedecke den Rost teilweise mit einer Kulturschale. Lassen Sie das Gitter 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen und bilden Sie dann das Gitter ab oder lagern Sie es in einer elektronenmikroskopischen Gitterbox für die zukünftige Beobachtung.