Isolierung mononukleärer Zellen von Lamina Propria: Eine Dichtegradientenzentrifugationstechnik auf Siliziumdioxidbasis zur Gewinnung mononukleärer Zellen aus dem Dickdarm der Maus

Die intestinale Lamina propria, die sich unterhalb des Darmepithels befindet, besteht aus lockerem Bindegewebe zusammen mit einem dichten Netzwerk von Kollagenfasern, das eine Vielzahl von Zellen wie Fibroblasten, mononukleäre Zellen, einschließlich Lymphozyten und Monozyten, enthält. Diese Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase.

Um mononukleäre Zellen zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme von Dickdarmfragmenten der Maus. Behandeln Sie die Fragmente mit einem Verdauungspuffer, der Kollagenase-Enzyme enthält. Kollagenase-Enzyme verdauen die Kollagenfasern im Gewebe und geben die Zellen in Suspension frei.

Sammeln Sie den Überstand und filtrieren Sie ihn durch Zellsiebe, um unverdautes Gewebe und Ablagerungen zu entfernen und eine einzellige Suspension zu erhalten. Fügen Sie dem Filtrat einen gekühlten Puffer hinzu, um die Kollagenase-Enzyme zu inaktivieren.

Zentrifugieren, um die Zellen zu trennen. Der Überstand, der die Enzyme enthält, wird verworfen und das Zellpellet in einem Trennmedium auf Siliziumdioxidbasis niedriger Dichte resuspendiert. Als nächstes schichten Sie die Suspension über ein Trennmedium auf Siliziumdioxidbasis hoher Dichte, um einen Trenngradienten zu erzeugen.

Zentrifugieren Sie die Mischung. Die mononukleären Zellen sedimentieren und bilden eine weiße Schicht an der Grenzfläche zwischen den Dichtegradientenschichten. Übertragen Sie die weiße Grenzschicht vorsichtig in ein frisches Röhrchen mit einem geeigneten Puffer.

Zentrifuge, um ein Pellet mit gereinigten mononukleären Zellen zu erhalten. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Puffer für die weitere nachgelagerte Analyse.

Geben Sie zunächst 20 Milliliter Kollagenase-Verdauungspuffer in das Röhrchen, das die gewaschenen Dickdarmfragmente enthält. Verschließen Sie das Röhrchen und legen Sie es für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius mit einer Rotationsrate von 2 x g in einen Orbitalschüttler. Stellen Sie sicher, dass die Gewebefragmente während des Rührens in ständiger Bewegung sind.

Gießen Sie 5 Milliliter Trennmedium mit einer Dichte von 66 % Siliziumdioxid in jedes der drei separaten 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen. Verwenden Sie anschließend eine serologische 25-Milliliter-Pipette, um nur den Überstand aus dem Kollagenase-Aufschluss 1 zu sammeln. Filtern Sie den Überstand durch ein 40-Mikroliter-Poren-Filtrationsgewebe-Zellensieb, das in ein sauberes konisches 50-Milliliter-Polypropylenrohr gegeben wird. Füllen Sie das Röhrchen vollständig mit gekühltem Dickdarmpuffer, um den Kollagenase-Verdauungspuffer zu löschen. Drehen Sie dann die Zellen, saugen Sie den Überstand an und halten Sie das Pellet auf Eis.

Führen Sie weiterhin den Kollagenase-Aufschluss 2 durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem die Kollagenase-Verdauung 2 abgeschlossen ist, spülen Sie die Gewebefragmente kräftig zwischen dem Röhrchen und einer 10-Milliliter-Spritze durch eine 18-G-Nadel mit stumpfem Ende hin und her. Wiederholen Sie diese Spülung für mindestens sieben bis acht Durchgänge und fahren Sie fort, bis keine groben Gewebefragmente oder Ablagerungen mehr sichtbar sind.

Führen Sie anschließend die Gewebedisaggregationssuspension durch ein 40-Mikrometer-Poren-Filtrationsgewebe-Zellsieb, das in ein sauberes 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen gegeben wird. Füllen Sie das Röhrchen bis zum Rand mit gekühltem Dickdarmpuffer, um den Aufschluss zu stillen und zentrifugieren Sie bei 800 x g und bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten.

Entsorgen Sie den Überstand durch Vakuumaspiration und ziehen Sie das resuspendierte Pellet aus dem Kollagenase-Aufschluss 1 in das entsprechende Röhrchen. Danach resuspendieren Sie jedes Pellet in 24 Millilitern Dichtetrennmedium auf 44 % Siliziumdioxidbasis pro Dickdarm. Verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um langsam 8 Milliliter dieses Mediums auf jedes der drei Röhrchen zu schichten, die 66 % Dichtetrennmedium auf Siliziumdioxidbasis enthalten.

Balancieren Sie die Röhrchen in den Zentrifugeneimern vorsichtig mit einer Waage oder einer Waage. Zentrifugieren Sie bei 859 x g und bei 20 Grad Celsius für 20 Minuten ohne Pause. Lassen Sie die Rotoren vollständig zur Ruhe kommen, bevor Sie die Röhrchen entfernen, und achten Sie darauf, die Zellen an der Gradientengrenzfläche nicht zu stören.

Visualisieren Sie die Gradientenschnittstelle in der Nähe der 5-Milliliter-Markierung, wo typischerweise eine 1-2 Millimeter dicke weiße Bande vorhanden ist. Vakuumieren Sie die oberen 7 Milliliter des Gradienten und verwerfen Sie sie, um einen leichteren Pipettenzugang zur Schnittstelle zu ermöglichen. Sammeln Sie mit kontinuierlichem manuellem Saugen und gleichmäßiger rotierender Bewegung des Handgelenks die Grenzschicht der Zellen. Sammeln Sie, bis die Grenzfläche zwischen den beiden Gradienten klar und refraktil ist, und übertragen Sie die Grenzfläche auf ein neues konisches 50-Milliliter-Polypropylenrohr.