Isolierung der Magenfunddrüsen: Eine Methode zur Isolierung von Fundusdrüsen aus menschlichem Magengewebe

Beim Menschen ist der Fundus der oberste Teil des Magens. Das Fundusepithel besteht aus zahlreichen Magendrüsen, die Magensaft absondern, der die Verdauung unterstützt.

Um die Magenfunddrüsen zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme von menschlichem Fundusgewebe in einem Becherglas. Geben Sie einen geeigneten Puffer in das Becherglas und waschen Sie das Fundusgewebe kräftig. Durch das Waschen werden die kontaminierenden Ablagerungen und das Blut aus dem Fundusgewebe entfernt.

Übertragen Sie das saubere Tuch auf eine Petriplatte. Wischen Sie mit steriler Gaze die schützende Schleimschicht ab und legen Sie so die darunter liegende Epithelschicht frei. Kratzen Sie mit einer Pinzette die oberste Epithelschicht gewaltsam aus dem Gewebe ab.

Übertragen Sie das geschabte Epithel auf eine andere Petriplatte und hacken Sie es in kleinere Stücke. Die zerkleinerten Stücke werden in einen Kolben gegeben, der einen Puffer enthält, der mit Kollagenase-Enzymen ergänzt ist. Bei der gewünschten Temperatur unter ständigem Rühren inkubieren, um ein Verklumpen zu vermeiden.

Kollagenase verdaut die in der Epithelschicht vorhandenen extrazellulären Matrixproteine und gibt die dissoziierten Fundusdrüsen in Suspension frei. Filtern Sie die Suspension in ein frisches Rohr, um undissoziierte Klumpen zu entfernen.

Halten Sie das Drüsenfiltrat ungestört auf Eis, um die Drüsen zu sedimentieren. Entsorgen Sie den Überstand mit den Zelltrümmern und resuspendieren Sie das Drüsensediment in einem frischen Puffer. Zentrifugieren Sie das Drüsenpellet und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung.

Sammeln Sie zunächst das vorbereitete Taschentuch in einem großen Plastikbehälter, der mit kalzium-/magnesiumfreiem DPBS gefüllt ist. Lassen Sie den Plastikbehälter bis zum Gebrauch auf Eis. Anschließend wird das Gewebe mit Hilfe einer Pinzette in einem sterilen Becherglas, das 100 Milliliter kalzium-/magnesiumfreies DPBS enthält, etwa 30 Sekunden lang kräftig gewaschen. Verwenden Sie dann eine sterile Gaze, um die Schleimschicht vom Epithel abzuwischen.

Verwenden Sie anschließend eine große Pinzette, um die Muskelschicht des Gewebes fest zu halten. Verwenden Sie dann eine große, gebogene hämostatische Pinzette und kratzen Sie das Epithel mit Kraft ab. Bewahren Sie das abgeschabte Epithel in einer sterilen Petrischale aus Polystyrol auf. Um die Verdauung des Gewebes zu optimieren, zerkleinern Sie das Epithelgewebe in Fragmente. Waschen Sie dann das Gewebe mit kalzium-/magnesiumfreiem DPBS, das mit Antibiotika ergänzt wird.

Waschen Sie sich mehrmals, um das Blut zu entfernen. Entsorgen Sie die Wäsche in einem Abfallbecherglas. Anschließend werden die gewaschenen Epithelfragmente in einem 125-Milliliter-Glaskolben mit rundem Boden mit einem 25-Milliliter-Rührstab und vorgewärmtem Inkubationsmedium gesammelt. Nach dem Sammeln der Gewebefragmente wird der Rundkolben mit einem Gummiseptum verschlossen. Führen Sie dann eine 20-G-Wirbelsäulennadel in die Septen ein. Verbinden Sie die Septen mit einem Gummischlauch mit einem Sauerstofftank.

Führen Sie 10 bis 15 Ausflussnadeln in die Septen ein, um einen Bruch zu verhindern, und befestigen Sie das Setup dann mit Klammern an einem Ringständer. Schalten Sie dann den Sauerstoffausfluss auf niedrig ein. Danach kalibrieren Sie das Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf einer Rührplatte für 30 bis 45 Minuten. Stellen Sie das Setup nach der Kalibrierung in das Wasserbad. Nach 15 Minuten Inkubation auf dissoziierte Drüsen prüfen.

Nach der gewünschten Inkubationszeit geben Sie mit einer serologischen Pipette 50 Milliliter vorgewärmtes DMEM/F-12 in das Inkubationsmedium. Als nächstes filtrieren Sie das durch eine sterile Gaze erhaltene Drüsengemisch in vier konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Dann das Filtrat 15 Minuten lang auf Eis inkubieren. Dadurch kann sich die Verschraubung am Boden des konischen Rohrs absetzen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um 40 Milliliter des Überstands von der Oberseite der Drüsensuspension zu verwerfen.

Resuspendieren Sie die restlichen 10 Milliliter des Drüsengemisches in 10 Millilitern DPBS, das mit Antibiotika ergänzt wird. Verteilen Sie dann die gesamte Mischung in 5-Milliliter-Zellkultur-Reagenzgläser. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 65 x g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren den Überstand vorsichtig entfernen.