JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:45 Min. • April 30th, 2023
Detrusor-Zellen der glatten Muskulatur (DSM), die in der Harnblasenwand vorhanden sind, bilden die primäre Funktionseinheit der Blase. Diese Zellen entspannen sich, um die Urinspeicherung in der Blase zu erleichtern, und ziehen sich zusammen, um den Urin freizusetzen.
Um DSM-Zellen zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme einer entnommenen menschlichen Harnblasenprobe. Waschen Sie die Probe, um Blutspuren und Ablagerungen zu entfernen. Befestigen Sie anschließend das Gewebe mit der Schleimhautoberfläche nach oben. Entfernen Sie das Fett, die Blutgefäße und die Schleimhautschicht, um die darunter liegende Detrusormuskelschicht freizulegen. Schneiden Sie dann das schleimhautfreie Gewebe in kleine Fragmente.
Behandeln Sie die Gewebefragmente mit einem Verdauungscocktail mit Papain und inkubieren Sie. Papain, ein proteolytisches Enzym, fördert die Verdauung von Proteinen in der extrazellulären Matrix, die die Zellen zusammenhalten, und leitet die Lockerung der Zellen in der Matrix ein. Entferne nun den Papain-haltigen Überstand.
Geben Sie Kollagenase-Enzymsuspension zu den Gewebefragmenten und inkubieren Sie bei physiologischer Temperatur. Kollagenase baut die extrazelluläre Matrix auf und erleichtert die Dissoziation der DSM-Zellen. Die Inkubation bei physiologischer Temperatur trägt dazu bei, die Integrität der DSM-Zellen zu erhalten. Entsorgen Sie den kollagenasehaltigen Überstand.
Waschen Sie die Gewebefragmente mit einem eiskalten Puffer, um eventuelle Enzymreste zu entfernen. Setzen Sie sie dann im Puffer erneut ein. Zerreiben Sie die mit Enzymen behandelten Gewebefragmente sanft, um eine vollständige Dissoziation aller nicht freigesetzten Zellen sicherzustellen und eine Einzelzellsuspension von DSM-Zellen zu erhalten. Lagern Sie die DSM-Zellen bis zur weiteren Verwendung bei niedrigen Temperaturen.
Beginnen Sie mit der Untersuchung der gesamten Dicke der Harnblasenprobe. Stecken Sie die Probe mit der Schleimhaut nach oben und der Serosa nach unten auf eine mit Silikon-Enantiomer beschichtete runde 150-Millimeter-Schale, die mit eiskaltem DS gefüllt ist, und entfernen Sie vorsichtig die gesamte Schleimhaut durch scharfes Sezieren.
Schneiden Sie mehrere schleimhautfreie Detrusor-, glatte Muskel- oder DSM-Stücke aus. Geben Sie 3 bis 6 DSM-Stücke in eine Tube mit 1 bis 2 Millilitern vorgewärmtem DS, das Papain und Dithiothreitol oder DS-P enthält. Inkubieren Sie sie 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und achten Sie darauf, das Röhrchen alle 10 bis 15 Minuten zu schütteln.
Nach der Inkubation den DS-P aus der Tube nehmen und die DSM-Stücke kurz mit eiskaltem DS waschen. Übertragen Sie den DS mit den DSM-Stücken in ein neues Rohr und entfernen Sie den DS, wobei die DSM-Teile am Boden des Rohrs verbleiben. Geben Sie 1 bis 2 Milliliter DS, das Kollagenase Typ II oder DS-C enthält, in das Röhrchen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter gelegentlichem Schütteln.
Entsorgen Sie das DS-C und waschen Sie die enzymbehandelten DSM-Stücke 5 bis 10 Mal mit eiskaltem DS. Lassen Sie den DS nach dem letzten Waschen im Röhrchen und zerkleinern Sie die Stücke vorsichtig mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette, um einzelne DSM-Zellen freizugeben.