Herstellung von Krebs-Sphäroidblöcken durch Schockfrosten: Ein Verfahren zur Konservierung von Krebs-Sphäroiden in gefrorenen Matrixblöcken

Krebs-Sphäroide sind dreidimensionale zelluläre Aggregate von Tumorzellen. Diese Sphäroide können in die Kollagenmatrix eingebettet werden, was zur Bildung von Sphäroidblöcken führt. Um einen Sphäroidblock schockfrosten zu lassen, platzieren Sie zunächst einen Kollagen-Gel-Sphäroidblock in der Mitte einer Histologieform.

Spülen Sie den Block mit einem geeigneten Puffer ab und ergänzen Sie die Form mit einer Fixierlösung. Inkubieren, damit diese Lösung in die Sphäroide eindringen und die zellulären Proteine vernetzen kann. Dieser Schritt trägt dazu bei, die Sphäroidstruktur für das nachfolgende Verfahren beizubehalten. Als nächstes aspirierst du die Fixierlösung.

Legen Sie den Sphäroid-Gelblock in eine frische Histologieform, die eine dünne Schicht Einbettungsmedium enthält. Überlagern Sie es mit mehr Einbettungsmedium, um den Sphäroidblock vollständig zu untertauchen. Tauchen Sie die Form schließlich für kurze Zeit in ein Flüssigstickstoffbad.

Durch das schnelle Einfrieren wird die Bildung größerer Eiskristalle im Inneren von Sphäroiden verhindert. Es hilft dabei, die Integrität der Sphäroide zu erhalten, ohne mechanische Schäden zu verursachen. Sobald sich die Einbettungsmediumschicht um den Sphäroidblock verfestigt hat, entfernen Sie den gefrorenen Block aus der Form. Lagern Sie den gefrorenen Sphäroidblock für die weitere histologische Analyse bei niedrigen Temperaturen.

Heben Sie zunächst mit einer kleinen Pinzette den Block aus Kollagengel und Sphäroiden vom Kammerschieber an. Legen Sie dann den Kollagengelblock in eine Histologieform aus Kunststoff. Spülen Sie den Kollagen-Gel-Block mit 1X PBS kurz aus und fixieren Sie ihn mit 4% PFA in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie danach den Kollagen-Gel-Block mit 1,5 Millilitern 1X PBS auf einem Shaker für 15 Minuten.

Tragen Sie eine dünne Schicht OCT-Compound auf den Boden einer neuen Histologieform aus Kunststoff auf. Legen Sie dann den festen und gewaschenen Kollagengelblock auf die OCT-Verbindung, bevor Sie den Rest der Form vorsichtig mit der OCT-Verbindung füllen. Halten Sie die Form 1 Stunde lang bei 4 Grad Celsius. Danach frieren Sie die Form auf einer 100-Millimeter-Petrischale, die auf flüssigem Stickstoff schwimmt, ein und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius.