Exosomenisolierung: Eine dichtebasierte Ultrazentrifugationstechnik, bei der Saccharosekissen verwendet werden, um Exosomen von konditionierten Medien kultivierter Zellen zu trennen

Exosomen - nanogroße, membrangebundene Vesikel, die funktionelle Biomoleküle tragen - werden von den meisten Zelltypen aktiv sezerniert und können aus in vitro Zellkulturüberständen isoliert werden. Um Exosomen zu isolieren, ernten Sie zunächst den Überstand oder das konditionierte Medium aus einer Zellkultur von Interesse. Das konditionierte Medium würde Exosomen, Proteine, Zelltrümmer und Vesikel enthalten.

Zentrifugieren Sie das Medium, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Sammeln Sie den exosomenhaltigen Überstand und filtrieren Sie ihn durch Zellsiebe, um die größeren Vesikel zu entfernen. Übertragen Sie ein bestimmtes Volumen des gefilterten Mediums in ein frisches Rohr. Mischen Sie anschließend geeignete Konzentrationen von Saccharose und Deuteriumoxid, um ein Saccharosekissen herzustellen - einen diskontinuierlichen Gradienten aus Saccharose.

Geben Sie ein bestimmtes Volumen der Saccharose-Kissenlösung in das medienhaltige Röhrchen; die Lösung bildet am Boden eine separate Schicht. Zentrifugieren Sie nun das Röhrchen mit hoher Geschwindigkeit. Das Saccharosekissen erleichtert die Migration von Exosomen aus dem Medium in die Saccharoselösung bei gleichzeitiger Beibehaltung der Integrität des Exosoms. Die Proteinverunreinigungen hoher Dichte befinden sich an der Grenzfläche zwischen der Saccharoselösung und dem Medium.

Den größten Teil der exosomenhaltigen Saccharoseschicht vorsichtig in ein frisches Röhrchen mit einem geeigneten Puffer überführen. Zentrifugieren Sie bei hoher Geschwindigkeit, um ein Pellet aus gereinigten Exosomen zu erhalten. Entsorgen Sie den saccharosehaltigen Überstand zusammen mit allen Proteinverunreinigungen. Das Exosom-Pellet in Puffer resuspendieren und bis zur weiteren Verwendung bei niedrigen Temperaturen lagern.

Um das gesammelte konditionierte Medium vorzuklären, zentrifugieren Sie es bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und das Pellet entsorgen. Nach Wiederholung dieses Zentrifugationsschritts mit dem zurückgewonnenen Überstand wird der Überstand wieder zurückgewonnen und das Pellet verworfen.

Zentrifugieren Sie dann den zurückgewonnenen Überstand bei 2.000 x g für 15 Minuten und 4 Grad Celsius. Bewahren Sie den Überstand auf und entsorgen Sie das Pellet. Filtrieren Sie den Überstand einmal durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, der an einer 20-Milliliter-Spritze befestigt ist, in ein frisches Zentrifugenröhrchen.

In der Zwischenzeit zur Herstellung einer 25%igen Saccharoselösung in Deuteriumoxid 1,9 Gramm Saccharose in einem Universalröhrchen genau abwiegen. Fügen Sie dann Deuteriumoxid hinzu, bis das Gewicht 7,6 Gramm erreicht. Füllen Sie dann ein Ultrazentrifugenröhrchen mit 22,5 Millilitern vorgeklärtem konditioniertem Medium.

Lege eine Glaspipette in das Röhrchen. Geben Sie 3 Milliliter Saccharoselösung durch die Pipette, so dass die Lösung eine separate Schicht unter dem konditionierten Medium bildet. Das Röhrchen mit der geschichteten konditionierten Saccharoselösung wird vorsichtig in den Eimer eines Ausschwingrotors gegeben.

Befestigen Sie die Schaufel im Rotor. Setzen Sie den Rotor in die Ultrazentrifuge ein und drehen Sie ihn 1,5 Stunden lang bei 4 Grad Celsius um 100.000 x g. Sammeln Sie jeweils 1 Milliliter der Saccharoseschicht aus dem Röhrchen, indem Sie eine P1000-Pipette verwenden, deren Spitze an einer 10-Mikroliter-Spitze befestigt ist, und geben Sie sie zum Waschen in eine Ultrazentrifugenflasche mit 20 Millilitern gefiltertem PBS.

Setzen Sie das Röhrchen in einen Festwinkelrotor ein und zentrifugieren Sie es bei 100.000 x g bei 4 Grad Celsius für 1,5 Stunden. Verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet mit 400 Mikrolitern gefiltertem PBS.