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Krebsforschung
0 Aufrufe • 3:04 Min. • April 30th, 2023
Exosomen - nanogroße, aus Zellen gewonnene Membranvesikel - haben das Potenzial, als therapeutische Verabreichungsmittel für doppelsträngige kleine interferierende RNA oder siRNA
zu dienen.Nach der Freisetzung in das Zytoplasma der Zielzelle bindet siRNA an den RNA-induzierten Silencing-Komplex. Der aktivierte Komplex erkennt und bindet dann an spezifische mRNA, reguliert deren Expression negativ und vermittelt das Gen-Silencing.
Um siRNA in Exosomen einzukapseln, kühlt man zunächst eine Elektroporationsküvette auf Eis. Mischen Sie anschließend Exosomen und spezifische siRNA in einem Röhrchen im gewünschten Verhältnis unter Verwendung eines geeigneten Elektroporationspuffers. Gib diese Mischung nun in die vorgekühlte Küvette.
Verschließen Sie die Küvette und setzen Sie sie in den Küvettenhalter des Elektroporators ein. Drehen Sie das Drehrad, um sicherzustellen, dass die Küvette Kontakt mit den Elektroporationselektroden hat. Führen Sie nun das ausgewählte Elektroporationsprogramm aus.
Bei der Elektroporation stören die elektrischen Pulse die Phospholipid-Doppelschicht der Exosomen, die im leitfähigen Puffer suspendiert sind. Dies führt zur Bildung von transienten Poren in der Exosomenmembran, die die Diffusion von siRNA in das Vesikel fördern. Der Puffer hilft, die siRNA-Aggregation zu verhindern.
Sobald die Elektroporation abgeschlossen ist, verschließen sich die Poren wieder und schließen die siRNA darin ein. Nehmen Sie zum Schluss die Küvette aus dem Elektroporator und geben Sie die Mischung in ein frisches Röhrchen. Lagern Sie die siRNA-verkapselten Exosomen bis zur weiteren Verwendung bei niedrigen Temperaturen.
Bevor Sie mit der Elektroporation beginnen, kühlen Sie die Elektroporationsküvette 30 Minuten lang auf Eis vor. Mischen Sie 7 Mikrogramm Exosomen mit 0,33 Mikrogramm siRNA im Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie einen Zitronensäurepuffer hinzu, um das Volumen von 150 Mikrolitern zu erreichen. Geben Sie das Exosom-siRNA-Gemisch mit einer Kunststoffpipette in die Elektroporationsküvette und verschließen Sie die Küvette.
Legen Sie die Küvette in der richtigen Ausrichtung in den Küvettenhalter des Elektroporators und drehen Sie das Drehrad des Elektroporators um 180 Grad im Uhrzeigersinn. Wählen Sie das gewünschte Programm aus und drücken Sie die Start-Taste, um die Elektroporation zu starten. Das Display zeigt einen erfolgreichen Impuls an.
Drehen Sie dann das Rad um 180 Grad gegen den Uhrzeigersinn zurück und entfernen Sie die Küvette. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um die Probe aus der Küvette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen zu entnehmen. Bewahren Sie die Tube vor der Weiterverarbeitung auf Eis oder im Kühlschrank auf, wenn Sie sie nicht sofort verwenden.