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Um renale tubuläre Epithelzellen oder TEC zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme einer frisch isolierten Mausniere in einer Petrischale. Ziehen Sie die Nierenkapsel ab - die dünne äußere Schicht, die die Niere umgibt - und entfernen Sie das Mark oder den innersten Teil der Niere, wobei die Rinde, die den Tubulus und die röhrenförmigen Epithelzellen enthält, übrig bleibt.
Hacken Sie die restlichen Nierenteile in kleine Stücke und inkubieren Sie sie in einem warmen Verdauungspuffer, der das Enzym Kollagenase enthält. Kollagenase baut das Kollagenprotein ab, das das Nierengewebe zusammenhält, und gibt die Nierentubuli und die Nierenzellen in Suspension frei.
Filtern Sie die Suspension, um unverdautes Nierengewebe zu entfernen. Geben Sie anschließend vorgekühlte Nährmedien zum Filtrat. Die niedrigere Temperatur neutralisiert die Kollagenase und stoppt die weitere Verdauung des Gewebes. Zentrifugieren Sie das Filtrat bei niedriger Geschwindigkeit, damit sich die dichteren Tubuli und Röhrenzellen absetzen können, während andere Zelltypen und Verunreinigungen in der Schwebe bleiben.
Entfernen Sie diese unerwünschte Überstandsfraktion und fügen Sie Nährmedien hinzu, um das Pellet wieder zu suspendieren. Die Suspension in eine mit Kollagen beschichtete Kulturschale aussäen und inkubieren. Die freien röhrenförmigen Zellen heften sich fest an das Kollagen, während die Tubuli in der Schwebe bleiben. Subkultur, um die nicht gebundenen Tubuli zu entfernen und die Primärkultur von tubulären Epithelzellen zu erhalten.
Um die entnommenen Nieren zu verarbeiten, entfernen Sie zunächst die Nierenkapseln und das Medulla. Dann hacken Sie beide Nieren in winzige Stücke und inkubieren Sie sie in 10 Millilitern eines Verdauungspuffers in einem 37 Grad Celsius heißen Ofen mit sanfter Rotation für 5 Minuten.
Entfernen Sie nach der Verdauung unverdautes Gewebe, indem Sie den Puffer durch einen 70-Mikron-Filter leiten. Nachdem Sie das verdaute Gewebe entnommen haben, fügen Sie 10 Milliliter Nährmedium hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Als nächstes zentrifugieren Sie die gefilterte Gewebesuspension bei 50 x g für 5 Minuten, um die röhrenförmigen Zellen zu pelletieren. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen, fügen Sie 5 Milliliter Nährmedium hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation, um alle verbleibenden röhrenförmigen Zellen zu sammeln.
Resuspendieren Sie nun das erste Pellet in 20 Millilitern Nährmedium und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 50 x g, um die gesammelten Zellen weiter zu reinigen. Entsorgen Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie beide Pellets in 10 Millilitern Nährmedium. Zählen Sie anschließend die lebenden Zellen mit Trypanblau-Färbung. Dann säen Sie bis zu 10 Millionen Zellen auf eine 60-Millimeter-Kollagen-beschichtete Schale und lassen Sie die röhrenförmigen Zellen über Nacht anheften.