Flüssigkeitsaspiration aus Maus-Glomeruli: Eine Methode zum Aspirieren von glomerulärer Flüssigkeit aus der Maus mittels Zwei-Photonen-vermittelter Mikropunktur

In der Niere leitet der Glomerulus - ein Bündel kleiner Blutgefäße, die in der Bowman-Kapsel eingeschlossen sind - die Blutfiltration ein und stößt die Abfallflüssigkeit in den umgebenden Bowman-Raum aus. Die Untersuchung des glomerulären Flüssigkeitsinhalts hilft beim Verständnis der Nierenphysiologie.

Um die glomeruläre Flüssigkeit zu aspirieren, bereiten Sie eine anästhesierte Maus vor, deren Niere chirurgisch nach außen gestreckt wird. Injizieren Sie nun Fluoreszenz-Dextran-Farbstoff in die Blutgefäße hinter der Augenhöhle der Maus. Fluoreszierende Dextran-Moleküle bewegen sich durch den Blutkreislauf und erreichen die Niere.

Aufgrund des hohen Molekulargewichts des Dextrans wird der fluoreszierende Farbstoff im Glomerulus zurückgehalten und verleiht ihm eine grüne Farbe. Unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop, das die Visualisierung tief sitzender Strukturen ermöglicht, lokalisieren Sie einen geeigneten Glomerulus, um einen adäquaten Zugang zur glomerulären Flüssigkeit zu erhalten.

Richten Sie als Nächstes eine mit roten fluoreszierenden Nanopartikeln beschichtete Mikropipettenspitze auf die Seitenachse der Niere aus. Schieben Sie die Pipettenspitze mit einem Mikromanipulator vor, um in die Niere einzudringen. Wenn die Spitze den Ziel-Glomerulus erreicht, stellen Sie die gewünschte Aspirationsrate ein, um die glomeruläre Flüssigkeit aus dem Bowman-Raum abzusaugen.

Das Fehlen von grüner Fluoreszenz in der roten Pipettenspitze deutet auf das Fehlen von Blutungen hin und bestätigt eine erfolgreiche Aspiration der glomerulären Flüssigkeit. Ziehen Sie anschließend die Pipette zurück und lagern Sie die Flüssigkeit in einem geeigneten Puffer für die weitere Analyse.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, tragen Sie Salbe auf die Augen auf und verwenden Sie Klebeband, um die Extremitäten einer 20 bis 25 Gramm schweren erwachsenen Maus ruhigzustellen. Verwenden Sie eine Enthaarungscreme, um alle Haare auf der linken Seite des Tieres zu entfernen, und verwenden Sie die Milz, um die linke Niere durch die Haut auf der dorsalen und kaudalen Seite der Milz zu lokalisieren.

Machen Sie einen 0,5 Zentimeter großen Schnitt in der Haut, gefolgt von einem kleineren Schnitt im Bauchfell, gerade groß genug, damit die Niere durchgedrückt werden kann. Extrudieren Sie die Niere mit sanftem Druck und legen Sie einen Polysiloxan-Nierenstabilisator um das Gewebe. Richten Sie die Niere mit dem Abstandshalter so aus, dass die äußerste Oberfläche der Niere etwa 1 Millimeter über den Stabilisator hinausragt und fixieren Sie die Niere mit Cyanacrylatkleber in der Form. Kleben Sie eine Kopfplatte auf die Stabilisatorform und befestigen Sie die Kopfplatte an den Befestigungsstangen auf der Grundplatte.

Füllen Sie dann die Vertiefung in der Polysiloxan-Stütze mit 1%iger Agaroselösung und halten Sie ein 10-Millimeter-Deckglas auf die Form, bis die Agarose fest ist. Versiegeln Sie das Deckglas mit Klebstoff auf der Kopfplatte und legen Sie einen Ring mit Zahnzement um das Deckglas an. Injizieren Sie dann 100 bis 150 Mikroliter FITC-Dextran retroorbital und bewegen Sie die Maus und die Fixierungsplatte schnell auf den Zwei-Photonen-Mikroskoptisch.

auf die Nierenoberfläche fokussiert haben, wechseln Sie in den nicht-scannenden Zwei-Photonen-Modus und erkunden Sie das Bildgebungsfenster, um einen Zielglomerulus zu lokalisieren, der mehr als 30 Mikrometer unter dem Deckglas und weniger als 400 Mikrometer von der lateralen Nierenkapsel entfernt ist. Notieren Sie den lateralen und vertikalen Abstand zum Zielglomerulus. Notieren Sie dann die x-, y- und z-Tischkoordinaten für den Glomerulus und heben Sie schließlich den objektiven Brennpunkt etwa 1 Millimeter in die Wassersäule an, ohne die x- und y-Tischkoordinaten zu ändern.

Treiben Sie die Pipettenspitze in die Wassersäule und schalten Sie die DAPI-Anregung ein. Bewegen Sie die Pipette in den Dimensionen X und Y bis zum Punkt der maximalen Fluoreszenz der Spitze. Dies wird das Zentrum des Ziels sein. Ändern Sie die Anregungseinstellung auf rot fluoreszierendes Protein und visualisieren Sie die Pipette mit dem Okular, um eine präzise Zentrierung in der Okularansicht zu ermöglichen.

Wechseln Sie zurück zu Zwei-Photonen, um die Pipette in der Live-Zwei-Photonen-Ansicht zu finden, und platzieren Sie die Spitze genau in der Mitte des Bildes. Dies ist die Registrierungsposition. Speichern Sie dann ein Bild der Pipette und registrieren Sie den Tisch und die Koordinaten des Mikropipettencontrollers. Entfernen Sie die Pipette aus der Wassersäule in der x-Achse, ohne die y- und z-Achsen zu bewegen, und bewegen Sie die Pipette Z auf die Z-Koordinate des Zielglomerulus und den Rand der Niere.

Notieren Sie sich die Stufe X und berechnen Sie die Nierenrandpipette X anhand des Versatzes von der Registrierungsstufe X. Erhöhen Sie die Stufe X, um die Stufe in Richtung Pipette zu bewegen, bis sich der Rand der Niere weit links vom Bildschirm befindet, aber sichtbar bleibt. Schieben Sie die Pipette wie gerade berechnet schnell bis etwa 100 Mikrometer von der Nierenrandpipette X entfernt vor. Erhöhen Sie die Rotverstärkung und beginnen Sie, die Pipettenspitze unter Live-Zwei-Photonen-Bildgebung langsam bis zum Nierenrand vorzuschieben, während Sie das rote Pixelhistogramm überwachen.

Fahren Sie die Pipette in der x-Achse langsam zur Glomerulus-Zielpipette X und behalten Sie dabei den Tisch X im Auge. Beim Erreichen des Glomerulus dokumentieren Sie die Position mit einem Z-Stapel. Wenn die Pipette in Position gebracht ist, stellen Sie die Mikropumpe so ein, dass sie 100 Nanoliter Perfluordecalin über einen Zeitraum von 2 Minuten injiziert, um die Durchgängigkeit der Pipette sicherzustellen und Verwirrungen durch das Verstopfen der Pipette während des Eintritts zu reduzieren. Stellen Sie die Mikropumpe nach 4 bis 6 Minuten Filtration so ein, dass sie bis zu 300 Nanoliter mit einer Geschwindigkeit von bis zu 50 Nanolitern pro Minute ansaugt.