Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, funktionsfähige kardiale Immunzellen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die Ratte beatmet und der Perikardsack, der das Herz umgibt, freigelegt wird. Als nächstes wird Hanks Balance Salt Solution oder HBSS in den Perikardraum injiziert.

Dann wird das HBSS aspiriert, das nun Immunzellen aus dem Perikardraum enthält. Schließlich wurde die Anzahl der Immunzellen berücksichtigt, die aus dem Isolierungsverfahren gewonnen wurden. Letztendlich können chemische Degranulations- oder Co-Kultur-Experimente, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzanalyse oder pharmakologische Behandlung der Zellen durchgeführt werden, um die Funktionalität und biologische Aktivität der kardialen Immunzellen zu bewerten.

Es werden drei Personen aus meinem Labor anwesend sein, die dieses Verfahren demonstrieren werden. Jennifer McLarty, eine Doktorandin, Giselle Melendez, eine Postdoktorandin, und mein Cheftechniker Will Spencer. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der Immunzellisolierung, z. B. der kollagenen Verdauung, besteht darin, dass sie eine unerwünschte Aktivierung und Schädigung von Immunzellen verhindert und die Reaktionsfähigkeit der Immunzellen auf experimentelle Behandlungen bewahrt. Bevor Sie beginnen, neigen Sie ein Schneidebrett in einem Winkel von 30 Grad.

Schneiden Sie dann mit einem Dremmel-Elektrowerkzeug die Hälfte bis drei Viertel des Endes einer 18-Gauge-Fasennadel ab. Eine kürzere Spitze für verwendet einen Endotrachealtubus, sobald die Ratte überwacht wurde. Um eine angemessene Anästhesie zu gewährleisten, rasieren Sie den Bauch, die Brust und den Rachen des Tieres und machen Sie dann einen Hautschnitt vom Mittelbauch bis unter das Kinn.

Als nächstes präparieren Sie die Muskeln des vorderen Dreiecks des Halses, um die Luftröhre freizulegen, sobald sie freigelegt ist, und platzieren Sie eine schwarze geflochtene Naht mit drei Nullen darunter. Machen Sie nun einen Schnitt in der Luftröhre zwischen den Knorpelringen und führen Sie die Luftröhre ein. Binden Sie die Drei-Null-Naht fest um die Luftröhre, um den Trachealtubus zu sichern.

Schließen Sie als Nächstes den Endotrachealtubus an ein Beatmungsgerät für Kleintiere an und leiten Sie die Atmung ein. Um eine ausreichende Sauerstoffversorgung von Herz und Lunge zu gewährleisten, bestätigen Sie das gleichmäßige Anheben und Senken des Brustkorbs bei der Ratte während des Ein- bzw. Ausatmens des Beatmungsgeräts. Bevor Sie mit der Isolierung von Immunzellen beginnen, füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit HBSS.

Schneiden Sie dann die Hälfte bis drei Viertel des Endes der weichen Teflonspitze eines intravaskulären Baxters mit 24 Gauge über der Nadel ab. Schneller Katheter, um eine kürzere Spitze für das Isolationsverfahren herzustellen. Platzieren Sie den 24-Gauge-Baxter intravaskulär über der Nadel.

Schnelle Katheterspitze auf der Spritze mit dem HBSS. Legen Sie dann die HBSS-gefüllte Spritze, alle Puffer und ein leeres konisches 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Machen Sie nun einen Mittellinienschnitt in der Bauchdecke vom linearen Alba zum Xiphoid-Prozess.

Beginnen Sie dann direkt mit dem Xiphoid-Prozess und machen Sie bilaterale Schnitte durch den Brustkorb. Fahren Sie in einem Winkel zur Achselhöhle fort und achten Sie darauf, die Lunge, das Herz oder das Perikard nicht zu zerreißen. Präparieren Sie dann das Zwerchfell von den unteren Rippen weg und schneiden Sie lateral nach medial.

Als nächstes verwenden Sie das falciforme Ligamentum als Orientierungspunkt, um zu markieren, wo das Perikard auf der gegenüberliegenden Seite des Zwerchfells befestigt ist. Heben Sie vorsichtig eine Seite des Brustkorbs an, um die Brusthöhle und das Herz freizulegen. Die Perikardpunktion: Aspirieren des HBSS und der Zellen und Wiedereinsetzen.

Die Spritze ist der kniffligste Teil des Eingriffs. Wenn Sie das Perikard leicht reißen, geraten Sie nicht in Panik. Solange das Perikard genug vom Herzen umgibt, um eine Schale um das Herz herum zu bilden, können Sie immer noch Waschungen über dem Herzen durchführen.

Wählen Sie einen Punkt auf dem Perikard etwa auf halbem Weg zwischen dem Brustbein und dem Herzen, vorzugsweise eher rostral als kordal, und schieben Sie die Teflonspitze des Schnellkatheters durch beide Schichten des Perikards. Sobald die Spitze an Ort und Stelle ist, füllen Sie den Perikardraum vorsichtig mit zwei bis drei Millilitern des HBSS. Wenn der Sack gefüllt ist, wechseln Sie die Spitze in die leere 10-ml-Spritze und setzen Sie die Spitze wieder in den Perikardraum ein.

Saugen Sie mit demselben Eintrittsloch so viel Puffer wie möglich ab und achten Sie darauf, dass die Spitze nicht zu nahe an die Wände des Perikardsacks kommt, während Sie für den Sog sorgen, insbesondere an der Unterseite des Herzens. Übertragen Sie dann den Puffer nach der Flüssigkeitsextraktion in das 15-Milliliter-Röhrchen. Halten Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius, füllen und entleeren Sie den Perikardsack mit zwei bis drei weiteren Millilitern HBSS.

Etwa drei bis vier weitere Male wird das zurückgewonnene HBSS in das 15-Milliliter-Röhrchen übertragen. Entfernen Sie nach jeder Wäsche das Herz, die Lunge und/oder anderes Gewebe, das für andere Studien benötigt wird. Halten Sie die Röhren auf Eis.

Bei Nichtgebrauch zentrifugieren Sie die gesammelten Immunzellproben 10 Minuten lang bei der 200-fachen Schwerkraft. Entfernen Sie bei vier Grad SIUs das Supinat und rekonstituieren Sie dann das Pellet. In einem Milliliter HBSS abgebildet.

Hier sind Beispiele für histologische Studien zur Bestimmung der Zellmorphologie und -reife nach kardialer Immunzellisolierung. Kardiale Mastzellen, die mit Toinblau und AUM-Blau und Seranin O gefärbt sind, sind links bzw. rechts dargestellt. Hier werden die Ergebnisse einer funktionellen Studie gezeigt, in der kardiale Mastzellen, die aus der epikardialen Region des Herzens isoliert wurden, mit bekannten Aktivatoren stimuliert wurden.

Die isolierten kardialen Mastzellen behalten die Fähigkeit zur Freisetzung von Histamin bei und werden mit 10 Mikrogramm pro Milliliter der Verbindung 48, 80 oder 10 Mikromolar der Substanz behandelt, P.In den nächsten beiden Abbildungen sind repräsentative Streudiagramme aus einer durchflusszytometrischen Analyse isolierter kardialer Immunzellen im ersten Streudiagramm CD dargestellt, in dem Perikardisolat wurden vier positive T-Zellen identifiziert. Im zweiten Scatterplot CD werden acht positive T-Zellen nachgewiesen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Integrität des Perikards zu schützen, wenn die Pufferlösung injiziert wird und wenn die Pufferlösung abgesaugt wird, die die Immunzellen enthält, dies erhöht die Ausbeute der erhaltenen Zellen.