Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die altersabhängige genomische Instabilität in Hefe zu untersuchen, indem die chronologische Lebensdauer mit einer Reihe einfacher DNA-Schadens- und Mutationsassays kombiniert wird. Dies wird erreicht, indem alle zwei Tage zunächst chronologisch alternde Kulturen beprobt und die Lebensfähigkeit durch die Bildung einer koloniebildenden Einheit oder KBE überprüft wird. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die DNA-Mutationen zu untersuchen, indem Alterungskulturen beprobt und Zellen auf mutationsspezifischem Selektionsmedium plattiert werden.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in DNA-Mutationen während der chronologischen Alterung der Hefe zeigen, indem die Ergebnisse des Mutationsassays auf die Lebensfähigkeit normalisiert werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Alterns zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen, die Alterung und genomische Instabilität in Arien miteinander verbinden. Um die chronologische Lebensdauer der Hefe oder CLS zu testen, inokulieren Sie zunächst eine einzelne Hefekolonie in einen Milliliter synthetisches vollständiges Glukose- oder SDC-Medium und inkubieren Sie sie über Nacht bei 30 Grad Celsius am nächsten Tag. Verdünnen Sie die Übernachtkultur in 10 Milliliter frisches SDC-Medium auf einen OD 600 von 0,05 bis 0,1 und inkubieren Sie sie drei Tage lang bei 30 Grad Celsius.

Am dritten Tag, wenn sich die Zellen in der stationären Phase befinden, verdünnen Sie jedes Eloqua 10.000 Mal in Autoklavenwasser, entfernen Sie dann zwei 10-Mikroliter-Aliquots aus dem Kolben und plattieren Sie 10 Mikroliter jeder verdünnten Kultur auf einer A-Y-E-P-D-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien entstehen. Die Anzahl der entstehenden Kolonien oder koloniebildenden Einheiten ab der Kultur am dritten Tag wird als 100%-Überleben angesehen.

Entfernen Sie in den folgenden Tagen weiterhin Aliquote aus der Alterungskultur, um sie zu überrichten. Entsprechende Anpassung der Verdünnungsfaktoren, um etwa 20 bis 100 Kolonien im CFU-Assay zu gewährleisten. Die Probenahme wird gestoppt, wenn die Lebensfähigkeit der Kultur unter 1 % gesunken ist. In der Regel zwischen den Tagen 11 und 13 kann die Zellviabilität auch in Zellen untersucht werden, die auf Platten gealtert sind.

Zu Beginn dieses Assays inokulieren Sie eine einzelne Kolonie in einen Milliliter synthetisches vollständiges Glukosemedium und inkubieren Sie über Nacht unter Schütteln bei 30 Grad Celsius. Wenn die Kultur auf etwa 10 bis acht Zellen pro Milliliter angewachsen ist, verdünnen Sie die Kultur mit Autoklavenwasser auf 100 bis 200 Zellen pro 10 Mikroliter und 1000 Zellen pro 10 Mikroliter. Bereiten Sie für jeden Stamm einen Satz von acht bis 20 Trytophan-Dropout-SDC-Platten vor, die entsprechend der Plattierungsdichte beschriftet sind.

Um sicherzustellen, dass 10 bis 100 Völker gezählt werden können, sollten in Erwartung einer verminderten Lebensfähigkeit während der Alterung zwei Aliquots von 10 bis 30 Mikrolitern verdünnter Kultur auf jede Platte gelegt werden. Inkubieren Sie die auf 30 Grad Celsius eingestellte Platte für die Dauer der Lebensdaueranalyse am Tag der Beschichtung und danach alle zwei Tage, entfernen Sie eine Platte und fügen Sie tropfenweise 0,5 Milliliter Trytophan hinzu, damit lebensfähige Zellen wachsen können. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius für weitere 48 bis 72 Stunden.

Nach 48 bis 72 Stunden. Zählen Sie die KBE für die Lebensfähigkeit für den Tag der Tryptophan-Ausgabe, um vier DNA-Schäden und die Mutationshäufigkeit während der chronologischen Alterung zu bestimmen. Eine Reihe von seltsamen mit besonderen Merkmalen werden parallel zum Wildtyp-Stamm für den Hefe-CLS-Assay gezüchtet.

Die Häufigkeit spontaner Mutationen kann durch Messung der Häufigkeit von Canna-Vanning-Resistenzen in einer chronologisch alternden Kultur bewertet werden. Mutationen in dem Kann-1-Gen, das für die Plasma-Arginin-Permease kodiert, machen Zellen resistent gegen das Arginin-Analogon L Canavan Canavan-resistente Zellen wachsen auf Arginin-Dropout Synthetische vollständige Mediumplatten, ergänzt mit L Canavan-Sulfat, Messung der trippositiven Reversionshäufigkeit in einem Stamm, der eine bernsteinfarbene Mutation im Trip enthält. Eine Beschichtungssequenz ermöglicht die Abschätzung der Basensubstitutionsrate während des chronologischen Alterungstrips der Hefe.

Positive Reversionszellen wachsen auf Tryptophan-Dropout-Platten. Der lysenegative Stamm EH one 50 weist eine Plus-Vier-Verschiebung im offenen Leserahmen auf, die zu einer Ochsenatrophie für Lysin führt, die durch kleine Insertions- oder Deletionsmutationen rückgängig gemacht werden kann. Die Revertanten werden auf Lysin-Dropout-Platten selektiert, um grobe chromosomale Umlagerungen oder GCR nachzuweisen.

Es wird ein mutierter Stamm verwendet, bei dem HX T 13 7,5 Kilobasen telomerisch zu Can eins auf Chromosom fünf durch ein U drei Kassettenmutationen in beiden Can 1 und U drei Genen gestört wird, die Zellen resistent gegen L Canavan bzw. fünf Fluororotsäure machen. Da die Häufigkeit von Punktmutationen, die in beiden Genen auftreten, gering ist, liefert die Analyse der Häufigkeit der Resistenz sowohl gegen El Canavan als auch gegen fünf Fluororotsäure eine Schätzung von gcr, um den Grad der homologen und homologen Rekombination zu überwachen. Während der chronologischen Alterung werden Mutanten erzeugt, die entweder 100 % homologe invertierte Wiederholungen oder 91 % homologe Wiederholungen tragen.

IRS an der seine drei Locus Rekombination zwischen den IRS ermöglicht die Expression von funktionellen seine drei Proteine. Daher wachsen Zellen, in denen eine Rekombination stattgefunden hat, auf Histidin-Dropout-Platten, die mit Galaktose ergänzt sind. Am dritten Tag, wenn sich die Zellen in der stationären Phase befinden und eine angemessene Menge an Zellen aus jeder Alterungskultur entnommen wird.

Da für alle Assays das gleiche Verfahren angewendet wird, wird nur eine Probe verarbeitet. Für die Zwecke dieses Videos pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie in einer Tischzentrifuge drehen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Autoklaven-Wasserpellet.

Entfernen Sie erneut den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern Wasserplattenzellen auf den entsprechenden Platten, um für die gewünschten Reverts auszuwählen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius nach drei bis vier Tagen und zählen Sie KBE, die Mutationshäufigkeit wird auf die Anzahl lebensfähiger Zellen normiert. Diese Grafik zeigt repräsentative Ergebnisse eines typischen chronologischen Lebensdauer-Assays, wenn das chronologische Überleben von Wildtyp-Zellen mit dem von S, CH, neun Delta-TOR, einem Delta-Mutanten und RAs, zwei Delta-Mutanten verglichen wird.

In Flüssigkulturen zeigen Mutanten, denen TOR eins, CH neun oder RAs zwei fehlen, eine verlängerte chronologische Lebensdauer. Darüber hinaus zeigen Mängel in s CH neun und RAs zwei einen additiven Effekt auf das chronologische Überleben der Langlebigkeitsförderung in Gegenwart verschiedener Kohlenstoffquellen. Die Verwendung des NC-Two-Viabilitätsassays ist in der nächsten Grafik dargestellt.

Am ersten Tag wurden SDC-Wildtyp-Kulturen verdünnt und ohne Kohlenstoffquelle auf SC-Trip-Dropout-Platten plattiert. SC Tripp Dropout-Platten, die mit Glukose-, Ethanol- oder Glycerin-Oraten ergänzt wurden, wurden alle zwei Tage bei 30 Grad Celsius inkubiert. Von jedem Set wurde eine Platte entnommen und entsprechende Nährstoffe hinzugefügt, um das Wachstum und die Koloniebildung zu ermöglichen.

Die altersabhängige Mutationshäufigkeit variiert stark je nach Stamm, Hintergrund, genetischer Manipulation, Kultur, Bedingungen und Alter. Diese Tabelle zeigt typische Ergebnisse, die in einem Wildtyp-Stamm erzielt wurden. Repräsentative Ergebnisse der Trans-Läsionssynthese sind in diesem nächsten Bild dargestellt.

Die altersabhängige Zunahme der Mutationshäufigkeit kann Veränderungen in der fehlerhaften DNA-Reparatur unter Verwendung von Kernextrakten und verschiedenen DNA-Templates beinhalten. Wir können die Translationssynthese oder TLS in den chronologisch gealterten Zellen auswerten. Kernextrakte aus drei Tage alten stationären Phasen-, Wildtyp- und SCH nine-Delta-Mutantenzellen wurden analysiert.

TLS-Produkte mit unbeschädigter Vorlage sind durch durchgezogene Linien gekennzeichnet und TLS-Produkte mit beschädigter Vorlage sind durch gestrichelte Linien gekennzeichnet. Es wurde keine Trans-Läsionssynthese in Kernextrakten aus den langlebigen s CH neun delta-mutierten freien Primern beobachtet, die durch den offenen Pfeil gekennzeichnet sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine chronologische Lebensdauer- und DNA-Mutationsanalyse bei Hefe durchführen.