Name: Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie altersabhängige genomische Instabilität in Saccharomyces cerevisiae untersuchen. Diese Methode kombiniert chronologische Lebensdaueranalysen mit DNA-Mutationsassays, um genetische Mechanismen des Alterns aufzuklären.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken S. Jinks Robertson und E. Heidenreich für die Bereitstellung von Plasmiden und Hefestämme; P. Pham und MF Goodman um Hilfe withthe TLS-Assay. Diese Arbeit wurde unterstützt, zum Teil von der American Federation für Alternsforschung zu gewähren und durch NIH AG20642, AG025135.

Zwei Lebensdauer Modelle eingesetzt, um Studie Altern in S. cerevisiae: RLS und CLS. Die replikativen (angehende) Lebensdauer (RLS) ist die Beobachtung, dass Hefe Mutter-Zellen eine endliche Anzahl von Divisionen 3-6 unterziehen basiert. Wir werden uns auf die chronologische Lebensspanne (CLS), ein Modell, das auf die chronologische Überleben der nicht-teilenden Hefe in der Kultur oder auf Platten 7-11 Basis zu konzentrieren. Wildtyp-Hefe wächst exponentiell für 10-12 Stunden in synthetischer Dextrose komplett (DEZA) Medium . Wenn Blutzuckerspiegel senkt, Hefe-Switches aus der Fermentation, um die Atmung, bezeichnet einen Prozess diauxisches verschieben. Cells weiterhin langsam teilen während der post-diauxisches Phase für rund 48 Stunden vor der Einfahrt G 0 zu verhaften. Die metabolische Rate der Zellen bleibt hoch bis zum Tag 5-6 (Tag 0 ist die Impfung Tag). Die Lebensfähigkeit der Zellen im Laufe der Zeit kann durch den Prozentsatz der chronologisch alternden Zellen abgetastet alle zwei Tage, die G 0 Verhaftung und bilden Kolonien, die auf reiche YPED Platten Ausfahrt zugegriffen werden kann. 1. Hefe chronologische Lebensspanne (CLS) in flüssiger Kultur <ol><li> Impfen einer einzigen Kolonie in 1 ml synthetischen vollständigen Glucose-Medium (SDC, Tabelle 1) beimpft und über Nacht unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Drei Impfkulturen von unabhängigen Kolonien sollten für jeden Stamm der biologischen Replikate bieten vorbereitet werden. </li><li> Verdünnen Sie die Übernacht-Kultur in frische DEZA Medium (meist 10 ml) bis OD = 0,05-0,1 (~ 1:100 Verdünnung) und inkubieren unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Dieser Zeitpunkt gilt als Tag 0 der chronologischen Alterung. Pflegen Sie ein 1:5-Verhältnis von Kultur / Flasche Volumen (10 ml Kultur in 50 ml, oder auch für längere / große Experimente 25 ml Kultur in 125 ml), um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten. </li><li> Ab Tag 3, zu entfernen 2 Aliquots von 10 ul aus dem Kolben, verdünnen 10.000 Mal in autoklaviert Wasser, 10 ul verdünnt Kultur (dh 10 4 -10) auf YEPD (1% Hefeextrakt, 2% Bacto Pepton, 2% Dextrose , 2% Agar) Platten, und inkubieren Sie bei 30 ° C für 48-72 Stunden vor dem Kolonie-bildenden vereinen (CFU) gezählt wird. </li><li> Tag 3 CFU gilt als 100% ige Überlebensrate. Verdünnungsfaktoren des Alterns Kultur in den folgenden Tagen sollte entsprechend angepasst werden, um ~ 20-100 Kolonien in der CFU-Assay (zB 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, etc.) zu gewährleisten. Für Wildtyp-Zellen in der DBY746 Hintergrund erreicht der CLS 1% Überlebensrate um Tag 11. </li></ol> Variationen in situ Lebensfähigkeit Assay sind: <ul><li> Kalorienreduktion (CR) von Glukose Einschränkung. Verdünnung der Übernacht-Kultur in Glukose begrenzt SC Medium (z. B. 0,5 oder 0,05% statt der üblichen 2% Glucose) in der Regel zu niedrigeren Bevölkerung Sättigungsdichte am Tag 3 führen, aber viel längeren mittleren und maximalen (10% Überlebensrate) Lebensdauer 12. </li><li> Für extreme CR / Hunger, waschen Tag 3 stationäre Phase Kultur (in der Regel 10 ml, wie in Schritt 3 oben) mit autoklaviertem Wasser (die Zellen in dem gleichen Volumen Wasser und Spin-Down bei 2500 rpm für 5 min, 3 Mal wiederholen). Incubationof Zellen in Wasser ahmt die Hungersnot der Bedingung, dass Hefe kann in freier Wildbahn zu begegnen. Alle zwei Tage später sollte alternden Kultur mit autoklaviertem Wasser gewaschen und erneut in dem gleichen Volumen Wasser, um alle Nährstoffe aus lysierten toten Zellen freigesetzt zu entfernen. Führen Sie die Lebensfähigkeit Assay durch Abtasten des alternden Kultur wie oben beschrieben. Dieser Hunger Bedingung wird auf fast eine Verdopplung der mittleren CLS im Wildtyp DBY746 Stamm 12 geführt. </li></ul> 2. In situ Lebensfähigkeit Test In den flüssigen Kultur, ein kleiner Bruchteil der überlebenden Zellen kann erneut eingegeben werden den Zellzyklus und wachsen Nutzung verbleibenden Nährstoffe oder Freigelassenen Form lysiert toten Zellen in das Medium, ein Phänotyp Nachwachsen bezeichnet / keuchend 13. Wir entwickelten eine Lebensfähigkeit-on-a-Plate-System, dass die Auxotrophie des DBY746 Stamm (trp1) nutzt, um das Nachwachsen / keuchend Problem zu umgehen und erlauben auch die Prüfung der Wirkung von konstanten Exposition oder der Entzug der verschiedenen externen Nährstoffen oder Reize auf Hefe CLS 11. Diese in situ Lebensfähigkeit Assay auch imitiert die replikativen Lebensspanne Modell, so dass Zellen werden ständig reichlich Nährstoffe für die Dauer der Lebensspanne Analyse ausgesetzt. <ol><li> Impfen einer einzigen Kolonie in 1 ml synthetischen vollständigen Glucose-Medium (DEZA) beimpft und über Nacht unter Schütteln (220 rpm) bei 30 ° C. Mindestens drei Impfkulturen von unabhängigen Kolonien sollten für jeden Stamm der biologischen Replikate bieten vorbereitet werden. </li><li> Lassen Sie die Kultur auf ~ 10 8 Zellen / ml (OD 600 = ~ 10) wachsen, verdünnen culturewith autoklaviertem Wasser auf 100-200 cell/10 ul (meist 10 4-fach verdünnt) und 1.000 Zellen/10 ul (10 3 -fachen Verdünnung). </li><li> Platte zwei Aliquots von 10-30 ul der verdünnten Kultur auf einen Tryptophan-Dropout DEZA Platte. Fürr jeden Stamm, bereiten eine Reihe von 8 bis 20 Platten und beschriftet nach Plattierungsdichte (z. B. 10 4-fach verdünnt, Platte 10 ul oder 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , etc.), die sicherstellen, 10-100 Kolonien in Erwartung einer verringerten Lebensfähigkeit kann während des Alterns gezählt werden. </li><li> Die Platte bei 30 ° C für die Dauer der Lebensspanne Analyse. </li><li> Am Tag der Beschichtung und alle 2 Tage später, entfernen Sie eine Platte und tropfenweise mit 0,5 ml Tryptophan (2 mg / ml), damit lebensfähige Zellen zu wachsen. Die Platte bei 30 ° C für weitere 48-72 Stunden. Zählen Sie die KBE Lebensfähigkeit am Tag der Tryptophan hinaus. Die CFU am Tag der Beschichtung wird als 100% ige Überlebensrate. </li></ol> Variationen in situ Lebensfähigkeit Assay sind: <ul><li> Age-Zellen auf Agarplatten (extreme Hunger-Bedingung). 1 ml 2x YPED statt Tryptophan an den nachfolgenden Tagen zu Wachstum und CFU zählen 14 zu ermöglichen. </li><li> Age-Zellen auf Platten mit dem Tryptophan-Dropout synthetischen Vollmedium mit verschiedenen Kohlenstoff-Quellen, zB verschiedenen Konzentrationen von Glukose (Kalorienreduktion durch Glukose Begrenzung), verschiedene Kohlenstoffquellen wie Ethanol, Glycerin, Essigsäure 14. 1 ml Glucose / Tryptophan-Lösung (20% Glucose und 1mg/ml Tryptophan), um Wachstum und CFU zählen können. </li><li> Andere Nährstoffe Manipulation, wie zum Beispiel Stickstoff. </li></ul> 3. DNA-Schäden und Mutationen Frequenz bei chronologischer Alterung Canavanin Widerstand (Can r) und can1 Sequenzierung Spontanmutationshäufigkeit kann durch Messung der Frequenz von Canavanin Widerstand (Can r) in chronologischer Alterung Kulturen ausgewertet werden. Mutationen in den CAN1 (YEL063) Gen, das die Plasma-Arginin-Permease kodiert, render Zellen resistent gegenüber der Arginin-Analogon L-canavanine.Can r Kolonien zu verschiedenen Zeitpunkten erhoben werden, auch kann für die Extraktion von genomischer DNA und anschließende Sequenzierung des CAN1 gespeichert werden Gen, das Mutationsspektrum Daten (mit Mutation Surveyor, SoftGenetics) bieten kann. Basensubstitutionen (Trp + Rückfälle) Stämme mit trp1-289 enthalten eine Amber-Mutation (C403T) im TRP1-codierende Sequenz. Messung der Frequenz von TRP1-289 zu Trp +-Reversion-15 ermöglicht die Abschätzung der Basenaustausch Rate während Hefe chronologischer Alterung. Frame-shift-Mutationen Die Lys - Stamm EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) birgt ein lys2ΔBgl II Mutation, die durch Einsetzen 4 Nukleotide eine Bgl II Restriktionsenzymstelle in der LYS2 Gen erstellen gebaut wurde . Die daraus resultierenden vier Verschiebung in den offenen Leserahmen Ergebnisse in Auxotrophie für Lysin, die durch kleine Einfügen / Löschen Mutationen 16-17 rückgängig gemacht werden kann. Gross chromosomale Umlagerungen (GCRs) Zur Erkennung grober chromosomale Umlagerungen (GCRs) erzielten wir einen mutierten Stamm, in dem HXT13 (YEL069), kodierend für eine hoch redundante Hexose-Transporter wurde von einem URA3 Kassette 18 unterbrochen. HXT13 liegt 7,5 kb Telomer zu CAN1 auf Chromosom V. Mutationen in beiden CAN1 und URA3-Gene machen Zellen Resistenz gegen L-Canavanin und 5-Fluororotsäure (5FOA) bzw.. Angesichts der niedrigen Frequenz von Punktmutationen, die in beide Gene, die Analyse der Can r 5FOA r Frequenz auftreten liefert eine Schätzung der GCRs dazu führen, dass der Verlust der beiden Gene. Homologe Rekombination und homeologous Zur Überwachung der Ebene der homologen (100%) und homeologous Rekombination (91%) bei chronologischer Alterung erzielten wir Mutanten, in denen linearisierten Plasmide (HIS3: Intron-IR-URA3), der entweder zu 100% homologen inverted repeats (IRs) (pSR406 ) oder 91% homeologous IRs (pSR407) am HIS3-Locus 19. Rekombination zwischen der IRS ermöglicht die Expression von funktionellen His3 Protein. <ol><li> Parallel zur normalen Lebensfähigkeit Assay (wie oben beschrieben), zu entfernen eine entsprechende Menge an Zellen aus der Alterung der Kultur, <ol><li> Can r Mutation, die mit ~ 2x10 7 Zellen (200 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen; </li><li> für Trp +-Reversion, mit ~ 10 8 Zellen (500-1000 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen; </li><li> für Lys + frame-shift Mutation, die mit ~ 10 8 Zellen (500-1000 ul von Tag 3 Kultur) zu beginnen; </li><li> für GCRs, mit 2-3x10 8 Zellen (2-3 ml Tag 3 Kultur) zu beginnen; </li><li> für die homologe Rekombination und homeologous, mit &amp; Tilde beginnen; 5x10 7 Zellen (200-500 ul von Tag 3 Kultur); </li></ol> Einstellung der Beschichtung Betrag entsprechend der Abnahme des Gesamt-Rentabilität und die Erhöhung der Mutationsrate bei chronologischer Alterung (Tabelle 2). Im Falle von Stämmen mit hypermutator Phänotyp (wie jene, mit Defiziten in der DNA-Reparatur), reduzieren Sie die Sampling-Betrag entsprechend. </li><li> Pellet die Zellen mit Tischzentrifuge Maschine (6000 rpm für 5 min). </li><li> Die Zellen in 1 ml autoklaviertem Wasser und Pellet die Zellen wieder. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 100 l Wasser. Platte Zellen, <ol><li> Can r Mutation, auf Arginin-Dropout-synthetischen Vollmedium-Platten (SDC-Arg, ergänzt mit 60 ug / ml L-Canavanin Sulfat); </li><li> für Trp + Reversion auf Tryptophan-Dropout-Platten (SDC-Trp); </li><li> für Lys + frame-shift Mutation, auf Lysin-Dropout-Platten (SDC-Lys); </li><li> für GCRs, auf Arginin-Dropout-Platten (SDC-Arg) mit 5FOA (1 mg / ml) und L-Canavanin Sulfat (60 pg / ml) ergänzt; </li><li> für die homologe Rekombination und homeologous auf Histidin-Dropout-Platten mit Galaktose (2%) ergänzt. </li></ol></li><li> Graf KBE nach 3-4 Tagen Inkubation bei 30 ° C. Die Mutationsrate ist es, die Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert. </li></ol> Ergänzend zu den in situ Lebensfähigkeit Assay, altersabhängige Trp +-Reversion, Lys + frame-shift Mutation, Rekombination, oder r können auch in den Zellen auf der Platte im Alter untersucht werden. <ol><li> Platte Zellen (~ 10 8 Zellen / Platte) auf Trp-, Lys-, His-Dropout-oder L-Canavanin synthetischen Vollmedium-Platten (wie oben beschrieben). </li><li> Alle zwei Tage (oder zum Zeitpunkt Point of Interest), erzielt das neu entstehende Kolonien. </li><li> Mutation Frequenz wird durch die Normalisierung der neu entstehenden Kolonien an der Gesamtzahl der lebenden Zellen des spezifischen Tag geschätzt. </li></ol> 4. Translesion Synthese (TLS) Die altersabhängige Mutationsfrequenz erhöhen können zu einem erhöhten Makromolekül Schäden, verminderte zelluläre Schutz / Reparatur und erhöhte fehlerhafte DNA-Reparatur (wie Polζ-abhängige translesion Synthese, TLS) während des Alterns. Zum Beispiel zeigen die langlebigen sch9 Δ Mutanten erhöhte Expression von SOD2 und verminderte Expression der fehlerhaften DNA-Reparatur-Enzym Rev1 20. Hier beschreiben wir einen Assay kombiniert geschädigte DNA-Template und ganze Kernextrakt die TLS in vitro zu evaluieren. <ol><li> Bereiten Kernextrakt wie von Wang et al 21;. Quantifizierung der Protein-Konzentration von BCA-Assay (Pierce). </li><li> Fügen Sie 0, 5, 10 oder 20 ug Kernextrakten zu 50 ul (Endvolumen) Reaktionen, die TLS-Puffer (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 μMdNTPs und 100 nM 5'-32 P-markierten 12-mer-Primer (5'-TGG CGA TAC GGA-3 ') geglüht, um eine 48-mer Vorlage mit DNA-Schäden von Interesse (5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 ', in denen X die beschädigte Stelle, zB Basenlücke, 8-oxo-G, etc.). </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 30 ° C für 30 min, kündigen die Reaktion mit der Zugabe von 2,5 ul EDTA (20 mM) und 2 ul Proteinase K (10 mg / mL). </li><li> Purify DNA mit Phenol-Extraktion und Ethanolfällung. </li><li> Resuspendieren DNA in 50 ul Gelladepuffer (98% Formamid, 20 mM EDTA und Farbstoff). </li><li> Beheben Sie den translesion Syntheseprodukte auf 19% Polyacrylamidgelen. </li><li> Quantifizierung der TLS mit Phosphorimaging (Abbildung 1). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wir in der Regel verwendet die KBE-Zählungen am Tag 3 zu 100 Prozent das Überleben in der Standard-Flüssigkeit CLS-Analyse. Der Anteil Überleben in den folgenden Tagen kann angebaut werden, die mittlere (50% Überleben) zu berechnen und die maximale (10% Überlebensrate) Lebensdauer 12. Lebensdauer ergibt sich aus der in situ Lebensfähigkeit Assay erhaltenen sind in der Regel im Einklang mit den mit der flüssigen CLS-Test, aber mit reduzierten die mittlere Lebensdauer, die zum Teil auf die Tatsache, dass die Zellen ständig, um Nährstoffe ausgesetzt ist. Anwesenheit von Glukose hemmt die Aktivität der zellulären Schutz zeigte durch die verringerte Transaktivierung von Stress-Reaktion Transkriptionsfaktor wie MSN2 / 4 und Gis1 12. Altersabhängige Mutationsfrequenz variiert stark je nach Stamm Hintergrund, Genmanipulationen, Kulturbedingungen und Alter. Tabelle 2 zeigt die typische Ergebnisse in den Wildtyp-Stamm (DBY746) erhalten. <table border="1"><tbody><tr><th> Komponente </th><th> g / L </th></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Ammoniumsulfat </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Nitrogen Base (-AS/-AA) </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td></td><td> mg / L </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Asparaginsäure </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Glutaminsäure </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Isoleucin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L-Lysin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Methionin </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Phenylalanin </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Serin </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L-Threonin </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L-Tryptophan </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Synthetic komplette Glucose-Medium, SDC (auf pH 6,0 mit NaOH). 4-facher Überschuss an Histidin, sind Leucin, Tryptophan und Uracil enthalten, um die Auxotrophie des DBY746 Belastung zu kompensieren. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Tag 3 (Mittelwert ± SEM) </th><th> Bis zu (während des Alterns) </th></tr><tr><td> Kann r </td><td> 1,76 ± 0,12 x10 -6 </td><td> 6-8 x10 -6 </td></tr><tr><td> Trp +-Reversion </td><td> 6,60 ± 1,70 x10 -8 </td><td> 1,60 x10 -6 </td></tr><tr><td> Lys + frame-shift Mutation </td><td> 3,00 ± 0,78 x10 -8 </td><td> 0,70 x10 -6 </td></tr><tr><td> GCRs </td><td> 0,62 ± 0,10 x10 -8 </td><td> 0,30 x10 -6 </td></tr><tr><td> Homologe Rekombination </td><td> 5,55 ± 2,74 x10 -6 </td><td> 27,00 x10 -6 </td></tr><tr><td> Homeologous Rekombination </td><td> 0,12 ± 0,04 x10 -6 </td><td> 0,48 x10 -6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Typische Mutation Frequenzen von Wildtyp-Zellen (DBY746) bei chronologischer Alterung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg"> Abbildung 1. Ergebnis translesion Synthese (TLS) 20. Nuclear Auszüge aus 3 Tage alten stationären Phase Wildtyp (DBY746) und sch9 Δ mutierten Zellen wurden mit unbeschädigten oder Basenlücke-haltigen DNA-Templates für 30 min bei 30 ° C inkubiert TLS Produkte zeichnen sich durch solide (mit unbeschädigten Vorlage) oder gepunktete (mit beschädigten Vorlage) angedeutet. Es gab keine translesion Synthese in nuklearen Auszug aus sch9 Δ Mutanten beobachtet. Kostenlose Primer sind durch die offene Pfeil gekennzeichnet.

<ol><li>Longo, V. D., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+medicine%3A+from+dwarf+model+systems+to+healthy+centenarians%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians.</a> Science. 299, 1342-1346 (2003).</li>
<li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328, 321-326 (2010).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183, 1751-1752 (1959).</li>
<li>Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calendar+life+span+versus+budding+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).</li>
<li>Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+control+and+cellular+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Replication control and cellular life span.</a> Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).</li>
<li>Pohley, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formal+mortality+analysis+for+populations+of+unicellular+organisms+%28Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).</li>
<li>Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+activity+is+essential+for+stationary+phase+survival+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Mitochondrial+production+of+toxic+oxygen+species+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.</a> J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).</li>
<li>Longo, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.+Studies+of+superoxide+dismutase%2C+Ras+and+Bcl-2+%5B%5D%22">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]</a>. , University of California Los Angeles. California Los Angeles. (1997).</li>
<li>Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+longevity+and+stress+resistance+by+Sch9+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast.</a> Science. 292, 288-290 (2001).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2, 73-81 (2003).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+extension+by+calorie+restriction+depends+on+Rim15+and+transcription+factors+downstream+of+Ras%2FPKA%2C+Tor%2C+and+Sch9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9.</a> PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).</li>
<li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tor1%2FSch9-regulated+carbon+source+substitution+is+as+effective+as+calorie+restriction+in+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension.</a> PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).</li>
<li>Capizzi, R. L., Jameson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+table+for+the+estimation+of+the+spontaneous+mutation+rate+of+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture.</a> Mutat Res. 17, 147-148 (1973).</li>
<li>Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+end+joining+as+an+important+mutagenic+process+in+cell+cycle-arrested+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells.</a> Embo J. 22, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Heidenreich, E., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-dependent+and+selection-induced+mutations+in+respiration-competent+and+respiration-deficient+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).</li>
<li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li>
<li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2%2FMsn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li>
<li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li>
<li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner%2FBloom+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Flüssige alternden Kulturen irgendwann weisen Nachwachsen / keuchend Phänotyp 13, die die CLS-Analyse erschwert. Nachwachsen der Regel tritt ein, wenn mehr als 90-99% der Bevölkerung Lebensfähigkeit verloren hat. Dieser Phänotyp ist häufig mit einem erhöhten oxidativen Stress und / oder verminderter Schutz in der Zelle verbunden sind. Zum Beispiel, die Frequenz dieser Phänotyp mehr als verdoppelt in Zellen ohne cytosolische Superoxiddismutase und reduziert in langlebigen Mutanten (zB sch9 Δ oder Ras2 Δ) oder Mutanten überexprimiert Superoxiddismutasen 22. In der Praxis definieren wir Nachwachsen wie eine Erhöhung der Rentabilität oder der Stabilisierung der Rentabilität für 3 aufeinander folgende Proben in der hohen Mortalität Phase bei chronologischer Alterung. Altersabhängige Häufigkeit der verschiedenen DNA-Mutationen variieren stark je nach Stamm Hintergrund, Genmanipulationen, Kulturbedingungen, sowie das Nachwachsen / keuchend und äußerst geringe Überlebenschancen. Pre-Experimente sollten zu den Zeitpunkten, wie die mittleren und maximalen Überleben mit verschiedenen Beschichtungs-Dichte für Mutationsassays Mutation Frequenzbereich vor performingthe Endwert Lebensdauer Analyse zu bestimmen sein. Die Wildtyp-Stamm sollte immer in einer Lebensdauer oder Mutationsfrequenz Studie aufgenommen werden parallel zu einer Behandlung oder genetische Mutanten, so dass inter-Experiment-Variationen für gerechtfertigt werden kann. Mehrere biologische Replikate sollten in die Studie aufgenommen werden, und sowohl flüssiger als auch in situ Lebensfähigkeit / Mutationsassays sollte durchgeführt werden, zu bestätigen die Ergebnisse. Statt sich auf eine bestimmte Art von DNA-Mutation, Profilierung der altersabhängigen genomische Instabilität mit mehreren Tests in Kombination, kann Licht auf spezifische DNA-Schäden und DNA-Schäden zu reparieren System (s), die altersabhängige genomische Instabilität beitragen zu vergießen. Zum Beispiel ist eine deutliche Steigerung des Brutto-chromosomale Umlagerungen (GCRs), im Vergleich zu denen anderer DNA-Mutationen, in Wildtyp-Hefe beobachtet, die auf eine elevationof Doppelstrangbruch und / oder eine Beeinträchtigung in nicht-homologen Ende (NHEJ) während der Hefe chronologischer Alterung (Tabelle 2). Die can1 Mutationsspektrum (Sequenzierung des CAN1-Gen) in den Wildtyp-Aging-Hefe gewonnen schlug eine Erhöhung der oxidativen Schäden bei chronologischer Alterung und fehleranfällige DNA-Reparatur; in der Erwägung, langlebige sch9 Δ Mutanten weniger oxidative DNA-Schäden und stark reduziert fehleranfällige translesion Synthese wurden 20 beobachtet. Hier beschriebenen Methoden können weitere aufgewendet werden, um altersabhängige genomische Instabilität zu studieren. Zum Beispiel kann ruhig und nicht-ruhenden Zellen von Hefe stationären Phase Kulturen mit der Dichtegradienten-Methode von Allen et al isoliert werden. 23. Zusammen mit der Mutation beschriebenen Tests hier haben wir berichtet, dass ein großer Teil der altersabhängigen Mutationen von ruhenden Zellen, anstatt die Grenze, beschädigt oder apoptotischen Zellen 20,24 entsteht.

studieren altersabhängige genomische instabilität mit der s. cerevisiae chronologisch lebensdauer modell

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studien mit dem Saccharomyces cerevisiae Alterung Modell haben Lebensspanne Regulationswege, teilweise in höheren Eukaryonten 1-2 sind konserviert aufgedeckt. Die Einfachheit und Leistungsfähigkeit der Hefe Alterung Modell kann auch untersucht werden, um DNA-Schäden und Genom-Wartung sowie ihre Beiträge zu Krankheiten während der Alterung zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein System zur Alters-abhängigen DNA-Mutationen, einschließlich Basensubstitutionen, frame-shift-Mutationen, grobe chromosomale Umlagerungen und homologen / homeologous Rekombination, sowie nukleare DNA-Reparatur-Aktivität durch die Kombination der Hefe chronologische Lebensspanne mit einfachen DNA-Studie Schäden und Mutationsassays. Die hier beschriebenen Methoden sollte die Identifizierung von Genen / Wege, die genomische Instabilität und die Mechanismen, die alters-abhängigen DNA-Mutationen und Krebs in Säugern zugrunde liegen, zu regulieren.

Hier beschreiben wir eine Reihe von DNA Mutationsassays, dass mit der Hefe chronologische Lebensspanne Modell, um die Gene / Wege, oder regeln dazu beitragen, genomische DNA Instabilität während des Alterns Studie kombiniert werden können.

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Studien unter Verwendung des Alterungsmodells von Saccharomyces cerevisiae haben regulatorische Signalwege der Lebensspanne aufgedeckt, die in höheren Eukaryoten teilweise konserviert sind1-2. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die altersabhängige genomische Instabilität in Hefe zu untersuchen, indem die chronologische Lebensdauer mit einer Reihe einfacher DNA-Schadens- und Mutationsassays kombiniert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst alle zwei Tage Proben aus Kulturen im chronologischen Alterungsprozess entnommen und auf Lebensfähigkeit mittels Koloniebildende-Einheit- oder CFU-Bildung überprüft werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die DNA-Mutationen zu untersuchen, indem alternde Kulturen beprobt und Zellen auf mutationspezifischem Selektionsmedium ausgestrichen werden.Schließlich können Ergebnisse erhalten werden, die Veränderungen in DNA-Mutationen während der chronologischen Alterung von Hefe zeigen, indem die Ergebnisse des Mutationsassays auf die Lebensfähigkeit normiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Alterungsforschung zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen, die Alterung und genomische Instabilität in Verbindung bringen. Um die chronologische Lebensdauer (CLS) von Hefe zu bestimmen, impfen Sie zunächst eine einzelne Hefe-Kolonie in ein Milliliter synthetisches komplettes Glucose-Medium (SDC) an und inkubieren sie über Nacht unter Schütteln bei 30 Grad Celsius. Am folgenden Tag verdünnen Sie die Übernachtkultur in 10 Milliliter frisches SDC-Medium auf einen OD600-Wert von 0,05 bis 0,1 und inkubieren sie unter Schütteln bei 30 Grad Celsius über drei Tage.Am dritten Tag, wenn sich die Zellen in der stationären Phase befinden, verdünnen Sie jede Eloqua 10.000-fach in autoklaviertem Wasser, entnehmen Sie dann zwei Aliquots zu je 10 Mikroliter aus dem Kolben und impfen Sie jeweils 10 Mikroliter der verdünnten Kultur auf eine A-Y-E-P-D-Platte aus. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien sichtbar werden. Die Anzahl der entstandenen Kolonien oder koloniebildenden Einheiten aus der Kultur des dritten Tages wird als 100 % Überlebensrate betrachtet.Entnehmen Sie in den folgenden Tagen weiterhin Aliquote aus der alternden Kultur, um sie zu plattieren. Passen Sie die Verdünnungsfaktoren entsprechend an, um sicherzustellen, dass etwa 20 bis 100 Kolonien im CFU-Assay entstehen. Die Probenahme wird eingestellt, wenn die Lebensfähigkeit der Kultur unter 1 % gesunken ist, was typischerweise zwischen den Tagen 11 und 13 der Fall ist. Die Zellviabilität kann auch an Zellen untersucht werden, die auf Platten gealtert wurden.Um diesen Assay zu beginnen, einen einzelnen Kolonie in ein Milliliter synthetisches komplettes Glucose-Medium impfen und über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Wenn die Kultur auf etwa 108 Zellen pro Milliliter angewachsen ist, die Kultur mit autoklaviertem Wasser auf 100 bis 200 Zellen pro 10 Mikroliter sowie auf 1000 Zellen pro 10 Mikroliter verdünnen. Für jeden Stamm einen Satz von acht bis 20 Tryptophan-ausfallenden SDC-Platten vorbereiten, die entsprechend der Auftragungsdichte beschriftet sind.Um sicherzustellen, dass 10 bis 100 Kolonien gezählt werden können, unter Berücksichtigung der verringerten Vitalität während des Alterns, plattieren Sie zwei Aliquots von 10 bis 30 Mikrolitern verdünnter Kultur auf jede Platte. Inkubieren Sie den Plattensatz bei 30 Grad Celsius für die Dauer der Lebensdaueranalyse. Am Tag des Plattiervorgangs und anschließend alle zwei Tage entnehmen Sie jeweils eine Platte und geben tropfenweise 0,5 Milliliter Tryptophan hinzu, um das Wachstum lebensfähiger Zellen zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Platte anschließend weitere 48 bis 72 Stunden bei 30 Grad Celsius.Nach 48 bis 72 Stunden. Zählen Sie die Koloniebildenden Einheiten (CFU), um die Vitalität am Tag der Tryptophan-Zugabe zu bestimmen, um DNA-Schäden und Mutationsfrequenz während der chronologischen Alterung zu analysieren. Eine Reihe von Stämmen mit besonderen Merkmalen wird parallel zum Wildtyp-Stamm für den Hefe-CLS-Test kultiviert.Die Frequenz spontaner Mutationen kann durch die Messung der Häufigkeit der Kanavaninresistenz in einer chronologisch alternden Kultur bestimmt werden. Mutationen im can1-Gen, das für die plasmatische Arginin-Permease kodiert, führen dazu, dass Zellen resistent gegenüber dem Arginin-Analogon L-Kanavanin werden. Kanavanin-resistente Zellen wachsen auf synthetischen kompletten Agarplatten ohne Arginin, die mit L-Kanavaninsulfat ergänzt sind. Die Messung der Trip-positiven Rückmutationsfrequenz in einem Stamm mit einer Amber-Mutation im trp1-Gen ermöglicht die Abschätzung der Rate von Basensubstitutionen während der chronologischen Alterung von Hefe.Zellen mit positiver Reversion wachsen auf Tryptophan-ausfallenden Platten. Der lysin-negative Stamm EH150 enthält eine +4-Rahmenverschiebung im offenen Leseraster, die zu einem Mangel an Lysin führt und durch kleine Insertionen oder Deletionen rückgängig gemacht werden kann. Die Revertanten werden auf Lysin-ausfallenden Platten selektiert, um grobe chromosomale Umstrukturierungen oder GCR (gcr = gross chromosomal rearrangements) nachzuweisen.Ein Mutantenstamm wird verwendet, bei dem HX T 13, das sich 7,5 Kilobasen telomerisch zu can eins auf Chromosom fünf befindet, durch eine U-drei-Kassette unterbrochen ist. Mutationen in beiden Genen, can eins und U drei, machen die Zellen resistent gegenüber L-Canavanin bzw. 5-Fluororotinsäure. Da die Häufigkeit von Punktmutationen in beiden Genen gering ist, ermöglicht die Analyse der Resistenzfrequenz gegenüber L-Canavanin und 5-Fluororotinsäure eine Abschätzung der GCR-Rate, um das Ausmaß homologer und nicht-homologer Rekombination zu überwachen. Während des chronologischen Alterns entstehen Mutanten, die entweder 100 % homologe invertierte Wiederholungen oder 91 % homologe Wiederholungen tragen.Die Rekombination zwischen den IRS an der his-three-Lokusstelle ermöglicht die Expression eines funktionsfähigen His-three-Proteins. Daher wachsen Zellen, in denen eine Rekombination stattgefunden hat, auf Histidin-ausfallenden Platten, die mit Galactose ergänzt wurden. Am dritten Tag, wenn sich die Zellen in der stationären Phase befinden, wird eine geeignete Menge Zellen aus jeder Alterungskultur entnommen.Da dasselbe Verfahren für alle Assays verwendet wird, wird nur eine Probe verarbeitet. Für dieses Video pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter autoklaviertem Wasser.Entfernen Sie erneut den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern Wasser. Impfen Sie die Zellen auf die entsprechenden Platten aus, um die gewünschten Revertanten auszuwählen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius. Nach drei bis vier Tagen zählen Sie die Koloniebildenden Einheiten (CFUs). Die Mutationsfrequenz wird auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen normalisiert. Dieses Diagramm zeigt repräsentative Ergebnisse aus einem typischen chronologischen Lebensdauer-Assay, bei dem das chronologische Überleben von Wildtyp-Zellen mit dem von S. cerevisiae ΔTOR1- und RAS2Δ-Mutanten verglichen wird.In flüssigen Kulturen weisen Mutanten, die TOR eins, CH neun oder RAs zwei fehlen, eine verlängerte chronologische Lebensspanne auf. Darüber hinaus zeigen Defizite in s CH neun und RAs zwei einen additiven Effekt auf die Förderung der chronologischen Überlebensfähigkeit in Gegenwart verschiedener Kohlenstoffquellen. Mit dem NC zwei-Vitalitätsassay wird dies im folgenden Diagramm gezeigt.Am ersten Tag wurden SDC-Wildtyp-Kulturen verdünnt und auf SC-Tripp-Dropout-Platten ohne Kohlenstoffquelle ausplattiert. Die SC-Tripp-Dropout-Platten, die mit Glukose, Ethanol oder Glycerol versetzt wurden, wurden bei 30 Grad Celsius alle zwei Tage inkubiert. Von jedem Satz wurde eine Platte entnommen und die entsprechenden Nährstoffe wurden zugegeben, um Wachstum und Koloniebildung zu ermöglichen.Die altersabhängige Mutationsfrequenz variiert stark je nach Stamm, Hintergrund, genetischer Modifikation, Kultur, Bedingungen und Alter. Diese Tabelle zeigt typische Ergebnisse, die in einem Wildtyp-Stamm erhalten wurden. Repräsentative Ergebnisse der Trans-Läsions-Synthese sind in diesem nächsten Bild dargestellt.Die altersabhängige Zunahme der Mutationsfrequenz könnte Veränderungen in der fehlerhaften DNA-Reparatur unter Verwendung von nukleären Extrakten und verschiedenen DNA-Vorlagen beinhalten. Wir können die Translations-Synthese bzw. TLS in zeitlich alternden Zellen bewerten. Nukleäre Extrakte aus drei Tage alten Zellen in stationärer Phase, Wildtyp- und SCH9Δ-Mutanten-Zellen wurden analysiert.TLS-Produkte mit unbeschädigter Vorlage sind durch durchgezogene Linien gekennzeichnet, TLS-Produkte mit beschädigter Vorlage durch gestrichelte Linien. In nukleären Extrakten aus den langlebigen s CH neun delta-Mutanten wurde keine Trans-Läsions-Synthese beobachtet; freie Primer sind durch den offenen Pfeil gekennzeichnet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die chronologische Lebensdauer und die DNA-Mutationsanalyse bei Hefe durchführt.

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Chronologischer Alterung in Hefe bezieht sich auf den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen mit der Zeit in der stationären Phase assoziiert. Hier beschreiben wir eine High-Throughput-Verfahren zur quantitativen Bestimmung Hefe chronologische Lebensspanne.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der replikativen Lebensspanne von Hefe Mutter-Zellen.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

Mutationsraten bei jungen Saccharomyces cerevisiae Zellen durch Fluktuation Tests gemessen werden zur Mutationshäufigkeiten für Mutterzellen der verschiedenen replikativen Alter vorherzusagen. Magnetische Sortierung und Durchflusszytometrie werden dann verwendet, um tatsächliche Mutationshäufigkeiten und Alter der Mutter Zellen zu messen, um Abweichungen von der erwarteten Mutationsfrequenzen zu ermitteln.

Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren Saccharomyces cerevisiae

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Hier beschreiben wir die Replikatgruppe Methode, Vorgehensweise quantitativ Messen C. Elegans Lebensdauer/überleben und Healthspan in hohem Durchsatz und robuste Art und Weise, so dass Screening von vielen Bedingungen ohne Einbußen bei der Qualität der Daten. Dieses Protokoll beschreibt die Strategie und bietet ein Software-Tool für die Analyse der Replikatgruppe Daten.

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

Hier ist ein Protokoll, um genetische Wechselwirkungen durch eine erhöhte Kopierzahl Suppressor-Bildschirm in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren. Diese Methode ermöglicht es Forschern, Suppressoren in kurzlebigen Hefemutanten zu identifizieren, zu klonen und zu testen. Wir testen den Effekt der Erhöhung der Kopierzahl von SIR2 auf die Lebensdauer in einem autophagy null Mutant.

Ein Suppressor-Bildschirm zur Charakterisierung genetischer Links, die die chronologische Lebensdauer in Saccharomyces cerevisiae regulieren

Die Bildgebungsplattform "The Lifespan Machine" automatisiert die lebenslange Beobachtung großer Populationen. Wir zeigen die Schritte, die erforderlich sind, um Lebensdauer-, Stressresistenz-, Pathogenese- und Verhaltensalterungstests durchzuführen. Die Qualität und der Umfang der Daten ermöglichen es den Forschern, Interventionen beim Altern trotz des Vorhandenseins biologischer und umweltbedingter Variationen zu untersuchen.

Hochdurchsatz-Behavioralitäts- und Lifespan-Assays mit der Lifespan Machine

Wir beschreiben eine qualitative Tests für Hefe Haftung und Agar-Invasion als Maß für die invasive und pseudohyphal Differenzierung. Dieser einfache Test kann verwendet werden, um den invasiven Phänotyp der verschiedenen Mutanten sowie die Auswirkungen Umweltreize zu bewerten und Signalwege auf Hefe Differenzierung.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

GFP-Fusionsproteine ​​sind weit verbreitet, um Organellen durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Allerdings Screening auf Mutationen, die die Morphologie der Organellen beeinflussen erfordert in der Regel individuelle Mutagenese und zeitaufwändig ist. Hier zeigen wir eine Methode, um gleichzeitig aufzunehmen Organellen-GFP-Marker in fast 5.000 Nicht-essentielle Gene in Hefe.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Erfahren Sie, wie Sie altersabhängige genomische Instabilität in Saccharomyces cerevisiae untersuchen. Diese Methode kombiniert chronologische Lebensdaueranalysen mit DNA-Mutationsassays, um genetische Mechanismen des Alterns aufzuklären.

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Weitere Videos entdecken