CRISPR-Interferenz-basiertes Gen-Silencing: Eine Technik zur gezielten Unterdrückung der Genfunktion in pathogenen Leptospiren

CRISPR-Interferenz oder CRISPRi verwendet eine deaktivierte Variante von Cas9, dCas9, für gezieltes Gen-Silencing, das die Genfunktion unterdrückt.

Um CRISPRi durchzuführen, verwenden Sie ein Shuttle-Vektor-Konstrukt - ein Plasmid, das Replikationsursprünge enthält, die sowohl E. coli- als auch Leptospira-Bakterien entsprechen, was die Vermehrung in beiden Spezies erleichtert.

Der Vektor enthält auch eine Sequenz, die spezifisch für das dCas9-Gen ist, und eine Single-Guide-RNA oder sgRNA, um die Zielsequenz zu erkennen.

Zunächst befindet sich der Shuttle-Vektor im Inneren des Spenders E. coli. Ergänzen Sie die Spenderkultur von E. coli mit dem Wirts-Leptospira, um die Konjugation zu erleichtern. Die Konjugation stellt einen direkten Zell-zu-Zell-Kontakt zwischen Organismen her und erleichtert die Aufnahme von Shuttle-Plasmiden durch Leptospira. Im Inneren der Zelle produziert das Plasmidkonstrukt sgRNA-Sequenzen und exprimiert dCas9-Proteine.

Die sgRNA enthält eine Protospacerregion, die ihre komplementäre Zielregion auf der Leptospira-DNA erkennt, in der Nähe des Protospacer-Nachbarmotivs oder PAM - eine kurze Erkennungssequenz auf der Wirts-DNA. Dies hilft dCas9, einen Komplex mit der sgRNA an der Zielstelle stromabwärts der Startstelle der Gentranskription zu bilden.

dCas9 aus dem sgRNA-dCas9-Komplex hat nicht die katalytische Aktivität, um DNA-Stränge zu spalten, stattdessen fungiert es als physikalische Barriere für die Bewegung von mRNA-bildenden RNA-Polymerase-Enzymen und hemmt schließlich die Gentranskription. Verwenden Sie das genstummgeschaltete Leptospira für weitere Tests.

Für die Konjugation werden Leptospira-Zellen bei 29 oder 37 Grad Celsius in HAN-Medien gezüchtet. Einen Tag vor der Konjugation werden Spenderzellen von E. coli in LB-Medien gezüchtet, die mit Diaminopimelsäure - DAP und Spectinomycin ergänzt sind.

Als nächstes, am Tag der Konjugation, züchten Sie die gesättigten E. coli-Kulturen in LB plus DAP. Montieren Sie in einer Biosicherheitshaube das Filtergerät, indem Sie den Membranfilter auf den Glasboden setzen, gefolgt von einem 15-ml-Glastrichter. Beide Teile werden durch die Federklappe zusammengehalten. Schließen Sie dann das Glas an eine Vakuumpumpe an. Geben Sie 5 ml Leptospira-Kulturen in den Trichter.

Fügen Sie als Nächstes den Stamm E. coli β2163 hinzu, der das gewünschte Plasmid enthält. Das Volumen variiert je nach optischer Dichte der Kultur. Wir streben ein Zellverhältnis von 1:1 an. Drehen Sie die Vakuumpumpe. Nun dringen Flüssigkeiten durch die Membran und die Zellen konzentrieren sich darauf.

Nehmen Sie den Filter und legen Sie ihn mit der Bakterienseite nach oben auf die EMJH-Platte plus DAP. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 29 Grad Celsius. Nehmen Sie dann die Filter aus den Platten und setzen Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen ein.

Verwenden Sie 1 ml flüssiges HAN-Medium, um die Zellen durch Pipettieren aus dem Filter zu gewinnen. Visualisieren Sie die zurückgewonnenen Zellen durch Dunkelfeldmikroskopie.

In diesem Stadium ist eine äquivalente Anzahl von E. coli und Leptospiren zu sehen. 100 bis 200 Mikroliter werden verwendet, um die Bakterien auf zwei HAN-Platten mit Spectinomycin zu verteilen. In diesem Stadium wird DAP weggelassen und E. coli wächst nicht. Die Platten werden bei 37 Grad Celsius und 3 % CO₂ inkubiert. Die Kolonien sollten zwischen 8 und 10 Tagen sichtbar sein.