JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:12 Min. • July 8th, 2025
Beginnen wir mit einem gentechnisch veränderten Mausmodell, das ein modifiziertes Genom umfasst, das LoxP-Stellen - spezifische Sequenzen, die von Cre-Rekombinase-Enzymen erkannt werden - beherbergt, die das interessierende Gen flankieren. Die Maus wird außerdem mit einem Plasmidvektor transfiziert, der für die organspezifische CreER-Rekombinase kodiert, was zur Integration des CreER-rekombinase-exprimierenden Elements in das Genom von Leberzellen führt.
Die exprimierte CreER-Rekombinase, ein inaktives Fusionsprotein, an dem die Cre-Rekombinase und die mutierte Ligandenbindungsdomäne des Östrogenrezeptors ER beteiligt sind, interagiert und bindet an das Hitzeschockprotein im Zytoplasma. Diese Bindung hält die CreER-Rekombinase im Zytoplasma fest.
Bereiten Sie eine Lösung von Tamoxifen, einem hydrophoben Medikament, mit Ethanol und geeignetem Öl vor. Injizieren Sie nun die Tamoxifenlösung intraperitoneal in den linken unteren Quadranten des Bauches der Maus, um eine Schädigung der Bauchorgane zu vermeiden.
Das injizierte Tamoxifen wird in der Leber zu 4-Hydroxytamoxifen, 4-OHT metabolisiert. Darüber hinaus bindet 4-OHT, ein selektiver Östrogenrezeptormodulator, an die ER-Ligandenbindungsdomäne der CreER-Rekombinase und bewirkt deren Konformationsänderung. Dies führt zur Freisetzung der CreER-Rekombinase aus dem Hitzeschockprotein.
Die aktivierten CreER-Rekombinasen translozieren in den Zellkern und erkennen die LoxP-Stellen im Wirtsgenom. Die CreER-Rekombination katalysiert die ortsspezifische Rekombination zwischen den LoxP-Stellen, was zur Exzision des interessierenden Gens führt und dadurch einen gewebespezifischen Gen-Knockout erreicht.
Initiierung der Induktion von Cre-Rekombinase 10 bis 15 Tage nach der Injektion in die Schwanzvene, um die Beseitigung nicht integrierter Vektoren zu ermöglichen. 10 Milligramm Tamoxifen in 40 Mikrolitern Ethanol auflösen und 10 Minuten lang bei 55 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren.
Mehrmals wirbeln, bis sich das Tamoxifen aufgelöst hat, dann 960 Mikroliter Maisöl hinzufügen und 5 Minuten bei 55 Grad Celsius inkubieren. Ziehen Sie die Lösung nach dem Abkühlen mit einer 20-Gauge-Nadel in eine 1-Milliliter-Insulinspritze und wechseln Sie dann zu einer 27-Gauge-Nadel.
Um zu injizieren, injizieren Sie zuerst die Maus, indem Sie den Hals der Maus vorsichtig mit dem Daumen und dem zweiten Finger greifen, den Schwanz zwischen der Basis der Hand und dem vierten und fünften Finger fixieren und dann intraperitoneal 0,1 Milliliter der Lösung in den linken unteren Quadranten des Bauches injizieren.