JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 4:34 Min. • July 8th, 2025
Für die reverse Transfektion von kleiner interferierender RNA oder siRNA, einer Klasse doppelsträngiger RNA, in nicht-adhärente Adipozyten oder Fettzellen wird eine Suspension von siRNAs hergestellt, die auf ein spezifisches proteinkodierendes Gen in Adipozyten abzielt. Fügen Sie ein geeignetes Transfektionsreagenz auf kationischer Lipidbasis hinzu. Inkubieren Sie das Gemisch, um durch elektrostatische Wechselwirkungen Transfektionskomplexe zu bilden.
Übertragen Sie die Mischung in kollagenbeschichtete Vertiefungen einer Multi-Well-Platte. Die Transfektionskomplexe immobilisieren sich auf der Plattenbeschichtung durch unspezifische Wechselwirkungen. Pipettieren Sie eine Suspension von Adipozyten in Vertiefungen, die immobilisierte Transfektionskomplexe enthalten. Die Adipozyten haften locker an der Plattenbeschichtung, wodurch der physikalische Kontakt zwischen den Zellen und Komplexen erhöht wird.
Der Transfektionskomplex verschmilzt mit der Zellmembran und gibt die siRNA in das Zytoplasma ab. Die siRNA, bestehend aus einem Antisense-Strang mit einer komplementären Sequenz zur Ziel-mRNA und einem Sinnesstrang, wird durch den Multi-Protein-RNA-induzierenden Silencing-Komplex (RISC) erkannt. Die siRNA bindet an den RISC, und die Stränge trennen sich, wobei der Antisense-Strang an den Komplex gebunden bleibt.
Der aktivierte siRNA-RISC-Komplex erkennt und bindet an die komplementären Stellen auf der Ziel-mRNA. Dies führt zu einer sequenzspezifischen Spaltung der mRNA durch das Argonautenprotein des RISC-Komplexes. Die gespaltene mRNA wird von der zellulären Maschinerie weiter abgebaut, wodurch die Expression des Zielgens stummgeschaltet wird.
Pipettieren Sie die siRNA mit einem verbesserten Minimum an essentiellem Medium zum Mischen und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie das Transfektionsreagenz und das verbesserte minimal essentielle Medium zur siRNA und pipettieren Sie sie, um sie zu mischen. Inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann die Transfektionsmischung in jede Vertiefung der mit Kollagen beschichteten Platte.
Waschen Sie die Zellen in der 100-Millimeter-Petrischale zweimal mit DPBS. Geben Sie 5X Trypsin in die Zellen und achten Sie darauf, dass die gesamte Oberfläche mit dem Trypsin bedeckt ist. Warten Sie 30 Sekunden und entfernen Sie vorsichtig das Trypsin. Inkubieren Sie die Petrischale für 5 bis 10 Minuten bei 37 °C im Inkubator.
Tippen Sie dann auf die Schale, um die Zellen zu lösen und Zellschäden zu vermeiden. Fügen Sie 10 Milliliter DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10% FCS und 1% Penicillin und Streptomycin hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig auf und ab, um die Zellen abzulösen und die Zellsuspension zu homogenisieren.
Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zählkammer oder einem automatisierten Zellzähler und stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 6,25 x 105 Zellen/ml Medium ein. 800 Mikroliter der Zellsuspension pro Vertiefung einer 12-Well-Platte oder 400 Mikroliter der Zellsuspension pro Vertiefung einer 24-Well-Platte, die die Transfektionsmischung enthält, aussäen.
Inkubieren Sie die Platten in einem Zellkultur-Inkubator und stören Sie sie 24 Stunden lang nicht. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand vorsichtig durch frisches DMEM ohne Pyruvat, 25 mM Glukose, 10 % FCS und 1 % Penicillin und Streptomycin und bringen Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück.