Induzierbares Tet-Off-regulierbares System: Eine In-vitro-Methode zur Modulation der Genexpression in kultivierten Zellen mit dem Tetracyclin-Off-System

Beginnen Sie mit der Einnahme einer Suspension von kultivierten Empfängerzellen in einem Röhrchen. Ergänzen Sie das Röhrchen mit induzierbaren Plasmiden, die das gewünschte Gen enthalten. Die Expression dieses Gens steht unter der Kontrolle einer vorgeschalteten Promotorsequenz, die mit einem Tetracyclin-Operator oder TeTo fusioniert ist und ein Tetracyclin-responsives Element oder TRE bildet.

Fügen Sie zusätzlich regulatorische Tetracyclin-off-Vektoren hinzu, die jeweils ein Gen enthalten, das für das rekombinante Tetracyclin-Transaktivatorprotein oder tTA kodiert. Elektropopolieren Sie das Zell-DNA-Gemisch, um elektrische Impulse zu verwenden, um die Aufnahme von Plasmiden durch die Zelle zu erleichtern.

Nach der Elektroporation die Zellen plattieren und für die gewünschte Zeit inkubieren. Beim Eintritt in den Zellkern exprimiert der Tetracyclin-off-Vektor das tTA-Protein. Das tTA ist ein Hybridprotein, das einen Tet-Repressor oder die TetR-Einheit und eine virale VP16-Transkriptionstransaktivatordomäne enthält.

Die TetR-Einheit bindet die TetO-Sequenz des TRE-Elements, während die VP16-Domäne es der RNA-Polymerase ermöglicht, die mRNA aus der nachgeschalteten DNA zu synthetisieren, was schließlich zur Genexpression führt. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium in der Kulturplatte durch Doxycyclin-haltiges Medium und inkubieren Sie.

Doxycyclin - ein synthetisches Tetracyclin-Analogon - bindet an das TetR-Protein und verändert dessen Konformation. Diese Veränderung stört die Interaktion des TetR-Proteins mit der TetO-Sequenz und hemmt die Expression des Zielgens.

Die Zellen werden in einer 1 x 10⁶ Zellen/cm² in 100-Millimeter-Petrischalen in Gegenwart eines vollständigen Minimums an essentiellem Medium ausgesät. 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit kultivieren. Geben Sie am nächsten Tag 500 Mikroliter vollständiges Medium ohne Antibiotikum in jede Vertiefung einer neuen 12-Well-Platte und wärmen Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius vor.

Während dieser Inkubation geben Sie 1 Mikrogramm des Reaktionsplasmids und 1 Mikrogramm des regulatorischen Vektors in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Well. Waschen Sie die Alveolarepithelzellen mit 10 Millilitern pro Vertiefung mit 37 Grad Celsius PBS ohne Kalzium oder Magnesium und behandeln Sie die Zellen mit 5 Millilitern pro Vertiefung mit 37 Grad Celsius 0,05% Trypsin für zwei bis vier Minuten im Zellkultur-Inkubator.

Wenn sich die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit 10 Millilitern pro Vertiefung des vollständigen Mediums ohne Antibiotikum und sammeln Sie die Zellen in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie das Geschirr mit 4 Millilitern frischem Medium, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln, und sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Pellet zum Zählen in 1 Milliliter PBS und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Das Pellet wird bei einer Dichte von 4 x 10⁷ Zellen/ml Resuspensionspuffer resuspendiert und 4 x 10⁵ Zellen in jedes Röhrchen mit Plasmid und Vektor durch vorsichtiges Mischen gegeben. Legen Sie 1 Röhrchen in das Elektroporationsgerät und füllen Sie das Röhrchen mit 3,5 Millilitern Elektrolytpuffer.

Drücken Sie den Kolben vollständig nieder, um eine vergoldete Elektrodenspitze in eine Pipette einzuführen, und mischen Sie den Röhrcheninhalt vorsichtig. Aspirieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pipette und führen Sie die Pipette in die Elektroporationsstation ein, bis ein Klickgeräusch zu hören ist. Wählen Sie das geeignete Elektroporationsprotokoll für Alveolarepithelzellen aus und drücken Sie auf dem Touchscreen auf Start.

Sie unmittelbar nach der Transfektion die Pipette und geben Sie die Zellen in eine Vertiefung der vorgewärmten 12-Well-Platte. Wenn alle Zellen elektroporiert und plattiert wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator und ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung nach zwei Tagen durch vollständiges Medium mit Antibiotika. Der Erfolg der Transfektion kann durch die Expression von EGFP bestätigt werden, wie sie mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Kontrollvektors beobachtet wird.

Um die Transkription des interessierenden Gens zu hemmen, ersetzen Sie 72 Stunden nach der Transfektion den Überstand durch 1 Milliliter pro Vertiefung des vollständigen Mediums, das mit 1 Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetem Doxycyclin ergänzt wird. Um die mRNA-Halbwertszeit des interessierenden Gens zu beurteilen, stellen Sie die Platte von 15 Minuten auf 6 Stunden wieder in den Zellkultur-Inkubator.

Waschen einer Vertiefung mit 1 Milliliter eiskaltem PBS, bevor die Zellen mit 500 Mikrolitern Lysepuffer aus einem kommerziell erhältlichen Phenol-Chloroform-RNA-Extraktionskit lysiert werden, und leichtes Schütteln zu jedem experimentellen Zeitpunkt. Isolieren Sie dann die RNA gemäß den Anweisungen des Kits und bestimmen Sie die RNA-Ausbeute und -Reinheit durch Spektrophotometrie bei 230, 260 und 280 Nanometern.