Morpholino-vermittelte Geneditierung: Eine Gen-Knockdown-Technik unter Verwendung von translational blockierenden Morpholino-Oligonukleotiden in einzelligen Höhlenfischeiern

Morpholinos sind kurze, einzelsträngige, neu gestaltete Oligonukleotide, die sich im Vergleich zu natürlichen Nukleotiden in ihrem Phosphatrückgrat und ihrer Zuckerstruktur unterscheiden. Diese Eigenschaften verbessern die Stabilität von Morpholinos bei physiologischem pH-Wert. Trotz dieser Variationen enthalten die Morpholinos die Standard-Nukleobasen, die bei der Entwicklung von Oligonukleotiden helfen, die komplementär zur spezifischen mRNA-Sequenz eines gewünschten Zielgens sind, das abgeschaltet werden soll.

Um eine morpholinogesteuerte Geneditierung durchzuführen, beginnen Sie mit der Entnahme einzelliger Höhlenfischeier, die in die Vertiefungen einer Agarose-Injektionsplatte gelegt werden. Visualisiere die durchscheinenden und runden Eier, um den Dottersack zu lokalisieren - eine flüssigkeitsgefüllte Struktur, die sich im Inneren des Eies befindet.

Nehmen Sie eine Mikroinjektionsnadel, die mit einer Lösung gefüllt ist, die designte Morpholinos enthält. Injizieren Sie die Lösung direkt in das Eigelb und stellen Sie sicher, dass die Morpholinos in das Zytoplasma der Zelle gelangen. Im Inneren der Zellen bildet das Zielgen die mRNA, die in das Zytoplasma transportiert wird.

Innerhalb des Zytoplasmas hybridisiert das injizierte Morpholino mit seinem komplementären Ziel-mRNA-Transkript an der endogenen Initiationsstelle und erstreckt sich über diese hinaus. Dieser Prozess blockiert die Bindung der größeren Untereinheit des Ribosoms an den entstehenden Translationsinitiationskomplex, der aus kleinen ribosomalen Untereinheiten besteht, die mit einigen spezifischen Proteinen komplexiert sind.

Anschließend wird das Fortschreiten des Translationsinitiationskomplexes sterisch behindert, wodurch die Translation der mRNA in das Protein gestoppt wird. Schließlich sinkt die Zielproteinkonzentration aufgrund der Translationsblockierung durch Morpholinos.

Am Tag der Injektion werden einzellige Eier mit einer Glaspipette in die Injektionsplatte übertragen und bis zu fünf Reihen der Injektionsplatte mit 30 bis 40 Eiern pro Reihe gefüllt. Halten Sie die Eier mit einer kleinen Menge Wasser aus dem Fischsystem hydratisiert. Tauen Sie Morpholino auf Eis auf und bereiten Sie die Injektionslösung so vor, dass 400 Pikogramm Morpholino pro Ei injiziert werden, indem Sie eine lange Microloader-Pipettenspitze verwenden oder einen Bolus von 2 bis 4 Mikrolitern am Ende hinzufügen.

Wenn alle Nadeln geladen sind, verwenden Sie eine Pinzette, um die überschüssige Länge der Injektionsnadelspitzen abzuschneiden, und montieren Sie die erste Nadel in einen Mikromanipulator, der mit einem Pikoliter-Mikroinjektor verbunden ist. Stellen Sie dann die Injektionsschale unter ein Präpariermikroskop und verwenden Sie den Mikromanipulator, um jedes Ei mit der Nadel zu durchdringen, bevor Sie 1 Nanoliter Morpholino-Injektionslösung direkt in das Eigelb injizieren.