Tol2-Transposon-vermittelte Zebrafisch-Transgenese: Ein Verfahren zur Erzeugung transgener Zebrafische nach Co-Injektion des Tol2-Systems in befruchtete Zebrafischembryonen

Beginnen Sie mit lebensfähigen, einzelligen Zebrafischembryonen, die in die Vertiefungen einer Mikroinjektionsform gelegt werden.

Beladen Sie eine Mikroinjektionsnadel mit einer Lösung, die Tol2-Transposase-kodierende mRNA und Transposon-Donor-Plasmide enthält. Die Plasmide bestehen aus einem ubiquitären Zebrafisch-Promotor und einem fluoreszierenden Protein-kodierenden Gen, das von Tol2-Transposon-Armen flankiert wird.

Injizieren Sie die Mikroinjektionslösung vorsichtig in das Zytoplasma des Zebrafischembryos. Innerhalb der Zelle werden Tol2-Transposase-mRNAs in Tol2-Transposase-Proteine übersetzt und aktiv in den Zellkern transportiert.

Tol2-Stellen auf dem Donorplasmid bestehen aus spezifischen invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs), die das Reportergen flankieren. Die ITRs werden von kurzen, direkten Rapporten flankiert. Transposase-Proteine erkennen und binden an die ITR-Stellen, wobei sie eine Haarnadel auf der flankierenden DNA bilden. Transposasen spalten das Transposon-Konstrukt weiter von der flankierenden DNA, lösen es aus dem Plasmid und hinterlassen kurze, direkte Wiederholungen.

Transposasen erzeugen einen gestaffelten Doppelstrangbruch im somatischen Zellgenom und fügen das Transposon-Konstrukt in die Genomstelle ein. Die Lückenfüllung der versetzten Enden durch DNA-Polymerase und die anschließende Ligation der Kerben erzeugen kurze, direkte Wiederholungen.

Die Ligation bewirkt eine stabile Integration des Transposon-Konstrukts in das somatische Zellgenom, und der Promotor erleichtert die Expression fluoreszierender Proteine. Inkubieren Sie die injizierten Embryonen. Während der Embryonalentwicklung entstehen aus somatischen Zellen verschiedene Zelltypen und es entstehen transgene Zebrafische.

Nach der Herstellung der Tol2-Transposase-mRNA und der Injektionslösung gemäß dem Textprotokoll werden am Nachmittag vor der Injektion vier bis sechs Aufzuchtbecken mit mindestens zwei Männchen und zwei Weibchen eingerichtet. Um die Menge an Fischabfällen zu reduzieren und eine Brutreaktion zu induzieren, vermeiden Sie es, die Fische am Nachmittag zu füttern.

Nehmen Sie am nächsten Morgen die vorbereitete Injektionslösung aus dem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius und legen Sie sie auf Eis. Ziehen Sie die Trennwände in den Zuchtbecken und lassen Sie die Fische sich paaren. In der Regel legen Fische innerhalb von 20 bis 30 Minuten Eier.

Ziehen Sie während des Wartens mit einem Mikropipettenabzieher mit den folgenden Parametern die Nadeln aus dem Kapillarglas. Verwende ein Labortuch, um das Ende der Nadel zu brechen und eine abgeschrägte Kante zu erzeugen. Ein kleinerer Durchmesser wird bevorzugt, um die Sterblichkeit der Embryonen zu verringern.

Sobald die Fische Eier gelegt haben, sammeln Sie sie in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern. Entfernen Sie sofort unter dem Präpariermikroskop alle abnormalen Embryonen und Fischabfälle. Pipettieren Sie dann die befruchteten Embryonen in eine vorbereitete 3%ige Agarose-Spritzgussform. Entferne überschüssiges Wasser, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten.

Sobald alle Reihen mit lebensfähigen Embryonen gefüllt sind, ordnen Sie sie so an, dass die einzelnen Zellen alle in einem 45-Grad-Winkel horizontal zur Nadel ausgerichtet sind. Dies erleichtert die spätere Injektion erheblich. Verwenden Sie anschließend mit Handschuhen eine 20-Mikroliter-Ladepipettenspitze, um 5 Mikroliter des vorbereiteten Konstrukts aus dem Röhrchen auf Eis zu entfernen.

Führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in das hintere Ende des zerbrochenen Kapillarröhrchens ein, bis es sich zu verjüngen beginnt, um das Reagenz so nah wie möglich an die Spitze zu bringen, und stoßen Sie es in die Kapillare aus. Wenn noch Luftblasen vorhanden sind, schütteln Sie die Nadel und achten Sie darauf, dass die Spitze nicht bricht.

Führen Sie die Nadel gerade in den Mikroinjektionsnadelhalter ein und ziehen Sie sie vorsichtig fest, bis die Nadel an Ort und Stelle bleibt, und stellen Sie dann den Winkel auf etwa 45 Grad ein. Sobald die Nadel vorbereitet und angebracht ist, schalten Sie das Mikroskop und den Gasdruckbehälter ein. Passen Sie das Injektionsvolumen an, indem Sie ca. 0,5 PSI für das Halten und 30 PSI für den Ausstoß verwenden.

Prüfen Sie, ob die Lösung beim Drücken des Pedals aus der Nadel austritt. Stellen Sie mit einem Tischmikrometer mit einem Tropfen Mineralöl das Volumen und den Durchfluss der Lösung auf einen Durchmesser von etwa 10 Mikrometern ein. Stellen Sie sicher, dass durch den Gegendruck eine kleine Menge Lösung aus der Nadel tropfen kann.

Wenn nicht genügend Gegendruck vorhanden ist, führt die Kapillarwirkung dazu, dass Flüssigkeit in die Nadel eindringt und die mRNA zerstört wird. Sobald die Nadel kalibriert ist, führen Sie die Nadel in die Einzelzelle der befruchteten Embryonen ein, indem Sie den Rand der Gelkerbe verwenden, um eine Unterlage zu schaffen, die den Embryo an Ort und Stelle hält und es der Nadel ermöglicht, Druck auszuüben, ohne den Embryo zu bewegen.

Sobald sich die Spitze der Nadel in der Einzelzelle befindet, drücken Sie das Pedal, um die gewünschte Menge der Lösung freizusetzen. Es ist wichtig, die Lösung in die Zelle zu injizieren, nicht das Eigelb für die Erzeugung von transgenen Zebrafischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Embryonen.

Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie eine Einweg-Transferpipette von 3,4 Millilitern und Wasser aus dem Fischsystem, um die injizierten Embryonen in eine beschriftete Schale zu übertragen, indem Sie sie aus der Agarosekerbe spülen. Lagern Sie die Embryonen in einem 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator, damit sie sich entwickeln können.