PiggyBac Transposon-vermittelte Geneditierung in humanen iPSCs: Ein Verfahren zur Integration von Genen von Interesse in humanen iPSCs mit dem PiggyBac Transposon-System

Beginnen Sie mit einer Suspension von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen, hiPSCs, in geeignetem Elektroporationspuffer. Es wird eine Lösung hinzugefügt, die aus PiggyBac-Transposase-kodierenden Plasmiden und Donorplasmiden besteht. Elektroporate die Mischung.

Die elektrischen Pulse permeabilisieren die Zellmembranen vorübergehend und erleichtern so die zelluläre Aufnahme von Plasmiden. Die Donorplasmide bestehen aus transposonspezifischen invertierten terminalen Repeats, ITRs, die invertierte Komplemente voneinander sind, flankiert von TTAA-Repeats, die das Zielprotein und die Antibiotikaresistenzgene umklammern.

Exprimierte PiggyBac-Transposase-Proteine erzeugen Kerben an den 3'-Enden der ITRs, die innerhalb der TTAA-Wiederholungen liegen. Die freigelegten 3'-Hydroxylgruppen greifen das Nukleotid des komplementären Strangs in der flankierenden DNA an und bilden TTAA-Haarnadeln an den Transposonenden, wodurch das Transposonkonstrukt aus dem Plasmid freigesetzt wird.

Transposasen lösen die Haarnadeln auf, um TTAA-Überhänge an den 5'-Enden des Transposon-Konstrukts zu bilden. Transposasen erzeugen außerdem Doppelstrangbrüche an der TTAA-Sequenz im Wirtsgenom. Die freigesetzten 3'-Hydroxyl-Transposonenden greifen die TTAA-Sequenz an den versetzten Enden an, was zu einer kovalenten Bindung des Transposonkonstrukts an das Wirtsgenom führt und Einzelstranglücken hinterlässt, die das Transposonkonstrukt flankieren. Diese Lücken in der Wirts-DNA werden ligiert, was zu einer stabilen Integration des Transposon-Konstrukts führt.

Behandeln Sie die hiPSCs, die auf einer mit extrazellulären Matrixproteinen beschichteten Platte mit antibiotikahaltigen Medien ausgesät wurden. Das Antibiotikaresistenzgen, das vom vorgeschalteten Promotor gesteuert wird, ermöglicht die Selektion von geneditierten Zellen.

Spülen Sie die humane iPSC-Kultur mit kalzium- und magnesiumfreiem PBS, bevor Sie die Zellen 5 bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einem Zelldissoziationsreagenz behandeln. Wenn sich die Zellen vom Kulturbehälter zu lösen beginnen, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zellen 3 bis 4 Mal vorsichtig manuell zu dissoziieren.

Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und bringen Sie das endgültige Volumen mit frischem PBS ohne Kalzium und Magnesium auf 10 Milliliter für die Zählung. Sammeln Sie 1 x 10⁶ Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Puffer R aus dem Elektroporationskit.

Fügen Sie 4,5 Mikrogramm transponierbare Vektorplasmid-DNA und 0,5 Mikrogramm der PiggyBac-Transposase-Plasmid-DNA für die Transfektion hinzu. Transfizieren Sie mit dem Zellelektroporationssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den angegebenen Parametern. Dann. säen Sie die Zellen in humanem iPS-Medium, das mit dem 10-mikromolaren ROCK-Inhibitor Y-27632 in einer 6-Millimeter-Matrix-beschichteten Schale ergänzt wurde.