JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:29 Min. • July 8th, 2025
Beginnen Sie mit einer Suspension von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen, hiPSCs, in geeignetem Elektroporationspuffer. Es wird eine Lösung hinzugefügt, die aus PiggyBac-Transposase-kodierenden Plasmiden und Donorplasmiden besteht. Elektroporate die Mischung.
Die elektrischen Pulse permeabilisieren die Zellmembranen vorübergehend und erleichtern so die zelluläre Aufnahme von Plasmiden. Die Donorplasmide bestehen aus transposonspezifischen invertierten terminalen Repeats, ITRs, die invertierte Komplemente voneinander sind, flankiert von TTAA-Repeats, die das Zielprotein und die Antibiotikaresistenzgene umklammern.
Exprimierte PiggyBac-Transposase-Proteine erzeugen Kerben an den 3'-Enden der ITRs, die innerhalb der TTAA-Wiederholungen liegen. Die freigelegten 3'-Hydroxylgruppen greifen das Nukleotid des komplementären Strangs in der flankierenden DNA an und bilden TTAA-Haarnadeln an den Transposonenden, wodurch das Transposonkonstrukt aus dem Plasmid freigesetzt wird.
Transposasen lösen die Haarnadeln auf, um TTAA-Überhänge an den 5'-Enden des Transposon-Konstrukts zu bilden. Transposasen erzeugen außerdem Doppelstrangbrüche an der TTAA-Sequenz im Wirtsgenom. Die freigesetzte
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