JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 2:59 Min. • July 8th, 2025
Für die Anionenaustauschchromatographie-Trennung eines interessierenden Proteins von einem dialysierten bakteriellen Proteinlysat fügen Sie einen Bindungspuffer hinzu, um die Lysatviskosität zu verringern und zu verhindern, dass die chromatographische Säule verstopft wird.
Die Chelatbildner im Puffer binden zweiwertige Kationen, hemmen die Proteaseaktivität und verhindern den Proteinabbau. Darüber hinaus bewirkt der Puffer mit einem pH-Wert über dem isoelektrischen Punkt des Zielproteins, pI, dem pH-Wert, bei dem das Protein keine Nettoladung hat, dass die überschüssigen negativ geladenen Hydroxylionen die positiv geladenen Amingruppen des Proteins neutralisieren, wodurch die Oberfläche des Proteins negativ geladen wird.
Bauen Sie die Anionenaustauschchromatographiesäule zusammen, die eine vernetzte, stationäre Phase auf Agarosebasis mit positiv geladenen quartären Amingruppen enthält. Fügen Sie den Bindungspuffer hinzu, um die Säule für eine maximale Proteininteraktion während der Probenbeladung vorzubereiten. Laden Sie das verdünnte bakterielle Lysat.
Die negativ geladenen Zielproteine binden fester an die positiv geladenen Gruppen in der Säule als weniger negativ geladene Proteine.
Lassen Sie den Bindungspuffer laufen, um ungebundene positiv geladene Proteine aus der Säule zu entfernen. Führen Sie einen Elutionspuffer durch die Säule und erhöhen Sie die Salzkonzentration allmählich. Bei niedrigen Salzkonzentrationen konkurrieren negative Ionen mit schwach gebundenen Proteinen um die Bindung an die Säule, was zu deren Elution führt.
Anschließend verdrängt der Puffer mit hoher Salzkonzentration fest gebundene Proteine von Interesse mit einer längeren Retentionszeit und eluiert die Zielproteine. Die gesammelten Zielproteine können für die weitere Analyse verwendet werden.
Starten Sie den FPLC mit allgemeiner Wartung. Verbinden Sie die Säulenpuffer AIEX-A und AIEX-B mit den Pufferventilen und die mit Anionenaustauscherharz enthaltende Säule mit den Säulenanschlüssen des FPLC. Passen Sie die allgemeinen chromatographischen Parameter entsprechend an.
Starten Sie das AIEX-Programm in der FPLC-Software und wählen Sie das Äquilibrierungsvolumen für Puffer A. Laden Sie anschließend die Probe auf die Säule und eluieren Sie die Proteine mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 100 % Puffer mit hohem Salzgehalt. Sammeln Sie 2-Milliliter-Fraktionen während der Elution.
Analysieren Sie die eluierten Fraktionen nach Beendigung des Laufs.