Calciumabhängige hydrophobe Interaktionschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von Calcium-bindenden Proteinen auf der Grundlage hydrophober Wechselwirkungen

Die kalziumabhängige hydrophobe Interaktionschromatographie ist eine Technik zur Trennung von kalziumbindenden Proteinen von anderen nicht kalziumbindenden Proteinen in einer Probe.

Nehmen Sie zunächst eine vormontierte Chromatographiesäule, die eine Matrix aus vernetzten Agarosekügelchen enthält, die mit hydrophoben Phenylgruppen derivatisiert sind, um Wechselwirkungen mit den Zielproteinen zu erleichtern. Äquilibrieren Sie es mit einem Bindungspuffer, der eine sehr hohe Konzentration an Calciumionen enthält, um eine maximale Interaktion zwischen Harz und Zielprotein während der anschließenden Probenbeladung

zu erzielen.

Es wird eine Probe entnommen, die das dialysierte Proteingemisch enthält, und diese mit einer Calciumchloridkonzentration ergänzt, die auch im Bindungspuffer für die Säulenäquilibrierung verwendet wird. Dadurch wird die Proteinbindung an die Säule maximiert.

Kalziumionen binden an bestimmte Proteine im Lysat und induzieren eine Konformationsänderung in diesen Proteinmolekülen, wodurch ihre hydrophoben Regionen freigelegt werden.

Filtern Sie das Gemisch, um Verunreinigungen und Zuschlagstoffe zu trennen und zu verhindern, dass sie die Säule verstopfen. Laden Sie dieses Filtrat in die voräquilibrierte Spalte. Proteine mit exponierten hydrophoben Bereichen interagieren mit den entsprechenden hydrophoben Phenylgruppen des Harzes.

Waschen Sie mit dem salzhaltigen Bindungspuffer, um ungebundene Proteine zu entfernen und die Probenreinheit in späteren Schritten zu verbessern. Führen Sie den calciumchloridfreien Elutionspuffer, der EDTA - einen zweiwertigen Chelator - enthält, durch die Säule.

Wenn EDTA die Calciumionen chelatisiert, werden die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem Zielprotein und dem Harz gestört. Die Zielproteine werden beweglich und eluieren aus der Säule.

Um die Proteinreinigung fortzusetzen, fügen Sie der Probe nach der Proteindialyse Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 25 Millimolar hinzu, was die Bindung von S100A12 an das Harz im nächsten Schritt erleichtert. Filtrieren Sie dann die Probe durch einen Filter mit einer Eingießgröße von 0,45 Mikrometern.

Äquilibrieren Sie HIC-Puffer und Proben auf 4 Grad Celsius. Verbinden Sie als Nächstes die Spaltenpuffer HIC-A und B und die Säule mit dem System und passen Sie die Parameter an.

Starten Sie die Methode, um die Säule mit 1 bis 2 Säulenvolumina des Puffers HIC-A zu äquilibrieren, und laden Sie die Probe und den "ungebundenen Probenblock waschen", wenn das UV-Signal wieder den Ausgangswert erreicht.

Beginnen Sie dann die Elution mit einem Calciumchelator-haltigen Puffer EDTA. Sammeln Sie während der Elution 2 Milliliter Peakfraktionen.