Größenausschlusschromatographie-basierte Trennung bakterieller extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Trennung heterogener Populationen gramnegativer bakterieller Vesikel der äußeren Membran anhand ihrer Größe

Unter geeigneten Kulturbedingungen geben gramnegative Bakterien frachttragende Vesikel der äußeren Membran (OMVs) an den Überstand ab. Diese Vesikel sind heterogen große, kleine, kugelförmige Strukturen, die die zelluläre Kommunikation vermitteln.

Um unterschiedlich große Subpopulationen von OMVs zu fraktionieren, nehmen Sie eine leere Größenausschlusschromatographiesäule mit einem geeigneten Filter an der Basis, um die Matrix zu stützen.

Verpacken Sie die Säule mit einer Gelfiltrationsmatrix, die aus chemisch inerten, kugelförmigen Kügelchen mit definierter Porengröße besteht, um sicherzustellen, dass die Größe optimal ist, um große OMVs vom Eindringen auszuschließen. Äquilibrieren Sie die Säule mit einem geeigneten Puffer, um ein Austrocknen der Kügelchen für eine optimale Reinigung zu verhindern.

Laden Sie den Bakterienkulturüberstand mit unterschiedlich großen Subpopulationen von OMVs, Proteinaggregaten und Nukleinsäuren auf die Oberseite der Säule. Lassen Sie die Proben durch die Schwerkraft laufen.

Während die Proben die Säule passieren, bewegen sich größere OMVs, die nicht in die Poren eindringen können, durch die Zwischenräume zwischen den Gelkügelchen, um zuerst eluiert zu werden. Währenddessen dringen die kleineren OMVs in die Matrixporen ein, nehmen einen längeren Weg und eluieren später.

Aufgrund ihrer geringeren Größe dringen die Proteinaggregate und Nukleinsäuren in verschiedene Poren in der Matrix ein, wodurch sie die längste Verweilzeit in der Säule haben und als letzte Fraktionen eluieren. Sammeln Sie separate OMV Eluate und lagern Sie sie für die weitere Analyse.

Verwenden Sie zunächst einen Glasstab, um eine Vorratsflasche mit Gelfiltrationsmedium zu mischen, und gießen Sie das zum Befüllen der Säule erforderliche Volumen plus ca. 50 % Überschuss in eine Glasflasche. Lassen Sie die Kügelchen absetzen und dekantieren Sie die überschüssige Flüssigkeit. Resuspendieren Sie die Kügelchen in Elutionspuffer zu einer endgültigen Lösung von ca. 70 % Gel und 30 % Puffer und entgasen Sie die Lösung unter Vakuum.

Montieren Sie die Säule auf einem Ringständer in vertikaler Position und füllen Sie die Säule mit Elutionspuffer, um die Wände zu befeuchten, bevor Sie den Puffer entleeren, bis nur noch etwa 1 Zentimeter übrig ist. Pipettieren Sie dann die Gelkügelchen vorsichtig in die Säule, während Sie gleichzeitig den überschüssigen Puffer ablassen, um ein Absetzen der Kügelchen zu verhindern, bis die Säule bis zu einer Höhe von etwa 2 Zentimetern unter dem Boden des Säulenreservoirs gepackt ist.

Entgasen Sie vor dem Laden der Probe den Elutionspuffer unter Vakuum. Waschen Sie die Säule mit etwa dem Zweifachen des Säulenvolumens des Elutionspuffers. Sobald der Puffer die Oberseite der Gelschicht erreicht hat, fügen Sie vorsichtig 2 Milliliter einer Vesikelprobe der äußeren Membran mit einem Gewicht von 100 bis 200 Nanomol pro Liter auf die Gelschicht hinzu, ohne die Oberfläche zu stören, und lassen Sie die Probe in das Gel gelangen.

Geben Sie den Elutionspuffer langsam in die Säule, ohne die Gelschicht zu stören, und legen Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen unter die Säule. Um ein Austrocknen der Säule zu verhindern, geben Sie gleichzeitig Elutionspuffer an die Oberseite der Säule.

Nachdem Sie 20 Milliliter Eluat gesammelt haben, stellen Sie ein Gestell mit 1,5-Milliliter-Röhrchen unter die Säule. Sammeln Sie insgesamt 96 1-Milliliter-Fraktionen in jedem Röhrchen. Während der Entnahme der Proben wird der Säule kontinuierlich Elutionspuffer zugeführt. Um die Säule zu reinigen, lassen Sie 1 Säulenvolumen mit 0,1 molarem Natriumhydroxid durch die Säule laufen, gefolgt von 2 Säulenvolumina Elutionspuffer.