Headspace-Gaschromatographie: Eine Technik zur Bestimmung der Ethanolkonzentration in Zebrafischembryonen

Um die Konzentration von Ethanol - einer flüchtigen organischen Verbindung - zu analysieren, nehmen Sie zunächst den homogenisierten, mit Ethanol behandelten Überstand aus der Zebrafischembryokultur in ein Chromatographiefläschchen. Der Überstand enthält neben Ethanol noch weitere nichtflüchtige organische Verbindungen. Stellen Sie das versiegelte Fläschchen in eine Probenahmeeinheit der Chromatographie-Baugruppe und erhitzen Sie es auf eine geeignete Temperatur.

Beim Erhitzen verdampft Ethanol und wandert in die Gasphase oder den Kopfraum, wobei die nichtflüchtigen Rückstände zurückbleiben. Dies ermöglicht es dem Probenehmer, gasförmiges Ethanol in einen kontinuierlichen Strom von Trägergas einzubringen. Dies fungiert als mobile Phase.

Ethanol strömt durch die vorgewärmte Coiled-Chromatographie-Säule, die ein gepacktes Bett der flüssigen stationären Phase enthält. Aufgrund ihrer Flüchtigkeit und Polarität beginnen die sich bewegenden Ethanolmoleküle an den Partikeln der stationären Phase zu adsorbieren und sich in die stationäre Phase aufzuteilen.

Aufgrund der hohen Säulentemperatur ist die Adsorption von Ethanolmolekülen instabil und vorübergehend, so dass diese Moleküle allmählich desorbieren und entlang des Trägergasstroms wandern können. Diese Ethanolmoleküle durchlaufen während der gesamten Säulenlänge eine Reihe von Adsorptions-Desorptions-Ereignissen.

Anschließend gelangt das Ethanol in eine Detektionskammer, in der seine Konzentration in der Probe bestimmt werden kann, die dem Bereich unter der Kurve im resultierenden Chromatogramm entspricht.

Verwenden Sie zwei p200-Mikropipetten mit einem Fassungsvermögen von 50 Mikrolitern und aspirieren Sie die Protease-Cocktaillösung in eine und Wasser in die zweite. Legen Sie dann schnell 10 Embryonen mit einer Glaspipette in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und schließen Sie die Kappe. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle zu testenden Proben, Kontrollen und mit Ethanol behandelten Embryonen.

Arbeiten Sie mit jeweils einer Probe, öffnen Sie schnell die Kappe und aspirieren Sie alle verbleibenden Embryomedien mit einer p200-Mikropipette, die auf 200 Mikroliter eingestellt ist. Fügen Sie schnell, aber vorsichtig die 50 Mikroliter Wasser hinzu und entfernen Sie sie, fügen Sie dann die 50 Mikroliter Protease-Cocktail hinzu und schließen Sie den Röhrchendeckel.

Lassen Sie die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, fügen Sie dann schnell 450 Mikroliter 5 molare Natriumchlorid hinzu und schließen Sie den Röhrchendeckel. Homogenisieren Sie die Probe durch 10-minütiges Vortexen und überführen Sie 2 Mikroliter Überstand in ein Gaschromatographie-Fläschchen. Verschließen Sie die Durchstechflasche mit einer Kappe aus Polytetrafluorethylen.

Laden Sie nach Abschluss der Startmethode 436 Current spme ethanol 2013 3-min absorb 2_5min rg-Lauf. METH aus dem Menü "Methoden" in der Analysesoftware für jede Probe in der Probenliste. Füllen Sie die Probenliste aus, beginnend mit den Luft-, Wasser- und 5 molaren Natriumchlorid-Protease-Cocktail-Rohlingen. Geben Sie dann die Ethanolnormen in der Reihenfolge von 0,3125 bis 40 Millimolar ein.

Befolgen Sie die Standards mit der zweiten Runde der Rohlinge. Geben Sie alle homogenisierten Embryoüberstandsproben ein, die getestet werden sollen, von der niedrigsten bis zur höchsten vorhergesagten Ethanolkonzentration, und geben Sie abschließend eine dritte Runde von Blindproben ein.

Geben Sie die Gaschromatographie-Fläschchen in der Reihenfolge, in der die Proben eingegeben wurden, in den Autosampler und lassen Sie sie 10 bis 15 Minuten erwärmen. Starten Sie dann die Beispielläufe mit der Software. Nachdem alle Ausführungen abgeschlossen sind, aktivieren Sie die Methode zum Herunterfahren, indem Sie der Beispielliste ein letztes Beispiel hinzufügen und den Standbymodus ausführen. METH. Sichern Sie alle Daten, die während des Beispiellaufs erfasst wurden.

Sobald die Methode zum Herunterfahren abgeschlossen ist, klicken Sie auf Chromatogramm öffnen und öffnen Sie den Ordner mit den Ergebnissen. Proben werden automatisch in dieses Programm integriert. Stellen Sie sicher, dass in den Ergebnissen die richtigen Peaks integriert wurden. Sobald alle Proben bestätigt wurden, drucken oder exportieren Sie die Ergebnisse.

Zeichnen Sie die Spitzenhöhe der Ethanolstandards in einem Diagramm auf. Berechnen Sie dann die Werte für die Steigung, den Y-Achsenabschnitt und das R-Quadrat. Der Ethanolwert für jede Probe wird ermittelt, indem die Peakhöhe der Probe vom Y-Achsenabschnitt der Standards subtrahiert und dieser Wert durch die Steigung der Standards dividiert wird.

Um die Ethanolkonzentration in den Embryonen zu berechnen, berechnen Sie den Verdünnungsfaktor für jede Probe und multiplizieren Sie den Ethanolwert der Probe mit diesem Verdünnungsfaktor. Berechnen Sie abschließend die Medienreferenzproben, indem Sie den Ethanolwert des Mediums mit einem Verdünnungsfaktor von 10 multiplizieren.