Multianalyt-Immunobead-Assay: eine flussbasierte Immunoassay-Technik zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antikörper-Subtypen in humanen Serumproben

Der Multianalyt-Immunbead-Assay verwendet mehrere antigenbeschichtete Mikrosphären, um die entsprechenden Zielantikörper gleichzeitig zu erkennen.

Um diesen Assay zu beginnen, nehmen Sie eine Mischung aus Mikrokügelchen in ein Röhrchen, das den entsprechenden Puffer enthält. Jede Perle ist mit einem spezifischen Antigen auf ihrer Oberfläche beschichtet, was eine einfache Unterscheidung der Kügelchen voneinander ermöglicht.

Pipettieren Sie die beschichtete Immunbead-Mischung in die Vertiefungen einer Mikrotiter-Assay-Platte. Ergänzen Sie die Vertiefungen mit der Serumprobe, die verschiedene Isotypen von Zielantikörpern enthält. Diese Varianten weisen subtile Unterschiede in ihren Strukturen auf, so dass jede Vertiefung mehrere Primärantikörper enthalten kann.

Inkubieren, damit sich die Antikörper-Isotypen der Probe an spezifische Antigene binden können, die auf den jeweiligen Immunbeads eingefangen sind. Waschen Sie mit einem Assay-Puffer, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen. Geben Sie Fluoreszenzfarbstoff-markierte Sekundärantikörper, die jeder Variante des Primärantikörpers entsprechen, in die Vertiefung

Jeder markierte Sekundärantikörper bindet an die Fc-Stelle des jeweiligen Primärantikörpers. Mehrere Bead-Capture-Antigen-Primär-Antikörperkomplexe werden fluoreszenzmarkiert. Waschen Sie die Platte, um ungebundene Sekundärantikörper zu entfernen.

Lesen Sie die Platte mit einem Fluoreszenzanalysator ab, der in der Lage ist, verschiedene Fluorophore bei ihren jeweiligen Wellenlängen gleichzeitig zu detektieren. Abhängig von der Signaldetektion können verschiedene Isotypen von Serumantikörpern und deren Bindung an verschiedene Antigene bestimmt werden.

Um die Assay-Leistung zu erzielen, resuspendieren Sie die gekoppelten Mikrosphären 30 Sekunden lang durch Vortex und beschallen Sie sie 60 bis 90 Sekunden lang. Entfernen Sie dann die erforderliche Menge jedes Bead-Kolloids aus dem jeweiligen Röhrchen und kombinieren Sie die Bead-Kolloide in einem neuen 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Führen Sie dann das Röhrchen in einen Magnetabscheider ein und lassen Sie es 60 Sekunden lang trennen. Während sich das Rohr noch im Magnetabscheider befindet, entfernen Sie den Überstand, ohne das Kügelchen zu stören.

Nachdem Sie die Kügelchen aus dem Separator entfernt haben, resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Assay-Puffer. 30 Sekunden lang vortexen, bevor Sie das Röhrchen für 60 Sekunden in einen Magnetabscheider legen, um die Kügelchen zu trennen. Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.

Als nächstes passen Sie die Konzentration der Drei-Plex-Arbeitsmikrosphärenmischung an, indem Sie ein geeignetes Volumen Assay-Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 Mikrosphären pro 1 μl für jedes Ziel zu erzeugen.

Aliquotieren Sie 25 Mikroliter der Mikrosphärenmischung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Plasma- oder Serumproben werden 500-fach in Assay-Puffer verdünnt und Standardproben entsprechend der gewünschten Titration vorbereitet.

Fügen Sie 25 Mikroliter Assay-Puffer als Blindprobe hinzu und geben Sie jede der verdünnten Proben oder den Standard in jede dafür vorgesehene Vertiefung einer 96-Well-Probenplatte. Wenn Sie fertig sind, decken Sie die Platte mit einem Aluminiumsiegel oder einer Folie ab und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler, der auf 700 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist.

Bereiten Sie eine Lösung von Anti-Human-Nachweisantikörpern oder Sekundärantikörperlösungen bei 4 μg/ml mit Assay-Puffer her, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie die Platte auf einen Magnetabscheider, um sie schnell zu waschen, und drehen Sie die Platte dann gewaltsam über einen Biohazard-Behälter, um Flüssigkeit aus den Vertiefungen zu entfernen. Während die Platte noch umgedreht ist, klopfen Sie mit Gewalt gegen ein dickes Papierbündel.

Waschen Sie dann jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern Assay-Puffer und entfernen Sie die Flüssigkeit durch gewaltsame Inversion über einem Behälter für biologische Gefahren. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Entsorgen Sie nach der letzten Wäsche alle gebrauchten Papierbündel in einem Behälter für biologische Gefahren.

Geben Sie anschließend 25 Mikroliter Sekundärantikörper-Arbeitslösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um sie auf einem Plattenschüttler mit 700 Umdrehungen pro Minute zu inkubieren.

Nach 30 Minuten Inkubation waschen Sie die Vertiefungen der Platte zweimal mit Assay-Puffer, wie bereits gezeigt. Geben Sie dann 100 Mikroliter Assay-Puffer in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur.

Analysieren Sie eine 60-Mikroliter-Probe über den Geräteanalysator gemäß dem Systemhandbuch.