JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:16 Min. • July 8th, 2025
Phospholipide sind komplexe Lipide, die Phosphatgruppen enthalten. Diese Moleküle werden durch ein Enzym namens Phospholipase hydrolysiert.
Um den Phospholipase-Aktivitätsassay durchzuführen, nehmen Sie eine Eigelbemulsion, die reich an Phospholipiden ist, die als Substrat für das Enzym dienen. Geben Sie das Eigelb in eine warme Agaroselösung, die Natriumchlorid enthält, was die Stabilität der Dotterproteine in den nachfolgenden Schritten erhöht.
Ergänzen Sie die Mischung mit Calciumchlorid und einem fluoreszierenden Farbstoff - Rhodamin. Gieße die Mischung in eine Petriplatte. Nach der Verfestigung bleiben die Dotterphospholipide homogen in der Agarosegelmatrix verteilt.
Erzeugen Sie mit einem Röhrchen Vertiefungen in angemessenem Abstand im Gel. Geben Sie unterschiedliche Konzentrationen von Rohproteinextrakt, der Phospholipase enthält, in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte bei physiologischer Temperatur.
Die Phospholipase aus dem Extrakt diffundiert radial in das Gel. Kalziumionen im Gel binden an die Phospholipase und aktivieren so die Enzyme. Dieses Enzym spaltet die Phospholipide und erzeugt freie Fettsäuren. Die Rhodamin-Moleküle im Gel bilden mit den freigesetzten Fettsäuren einen Komplex.
Beobachten Sie bei der Beleuchtung mit ultraviolettem Licht das Auftreten von fluoreszierenden Lichthöfen um die Vertiefungen. Der Halo bestätigt das Vorhandensein von Enzymaktivität. Mit höheren Konzentrationen von Phospholipase diffundieren die Enzymmoleküle weiter, wodurch sich der Durchmesser des Halos vergrößert.
Ein Hühnerei mit 1 % SDS in destilliertem Wasser waschen und das Eigelb steril vom Eiweiß trennen.
Bereiten Sie die Lösungen A, B, C und D vor. Geben Sie 500 Mikroliter der Lösungen A und C zu Lösung B und 100 Mikroliter Lösung D. Mischen Sie sie und gießen Sie 25 Milliliter in jede Petrischale. Warten Sie, bis sich die Lösung unter sterilen Bedingungen verfestigt hat, und machen Sie mit einem dünnen Röhrchen Vertiefungen mit einem Durchmesser von etwa 2 bis 3 Millimetern.
Geben Sie insgesamt 20 Mikroliter Phosphatpuffer als Negativkontrolle in eine Vertiefung und 20 Mikroliter einer bestimmten Phospholipase als Positivkontrolle in eine andere Vertiefung
.Geben Sie unterschiedliche Mengen des Rohextraktproteins - 5, 15, 25, 35 und 45 Mikrogramm - in die verbleibenden Vertiefungen, jeweils in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern. Inkubieren Sie 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.