Phospholipase Activity Assay: Ein Geldiffusionsassay zur Bestimmung der Phospholipase Aktivität in Rohgiftextrakt aus Anthopleura dowii

Phospholipide sind komplexe Lipide, die Phosphatgruppen enthalten. Diese Moleküle werden durch ein Enzym namens Phospholipase hydrolysiert.

Um den Phospholipase-Aktivitätsassay durchzuführen, nehmen Sie eine Eigelbemulsion, die reich an Phospholipiden ist, die als Substrat für das Enzym dienen. Geben Sie das Eigelb in eine warme Agaroselösung, die Natriumchlorid enthält, was die Stabilität der Dotterproteine in den nachfolgenden Schritten erhöht.

Ergänzen Sie die Mischung mit Calciumchlorid und einem fluoreszierenden Farbstoff - Rhodamin. Gieße die Mischung in eine Petriplatte. Nach der Verfestigung bleiben die Dotterphospholipide homogen in der Agarosegelmatrix verteilt.

Erzeugen Sie mit einem Röhrchen Vertiefungen in angemessenem Abstand im Gel. Geben Sie unterschiedliche Konzentrationen von Rohproteinextrakt, der Phospholipase enthält, in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte bei physiologischer Temperatur.

Die Phospholipase aus dem Extrakt diffundiert radial in das Gel. Kalziumionen im Gel binden an die Phospholipase und aktivieren so die Enzyme. Dieses Enzym spaltet die Phospholipide und erzeugt freie Fettsäuren. Die Rhodamin-Moleküle im Gel bilden mit den freigesetzten