Citratsynthase-Aktivitätsassay: Ein kolorimetrischer Assay zur Messung der mitochondrialen Citratsynthase-Aktivität in Drosophila-Gewebehomogenaten

In den Mitochondrien ist die Citratsynthase, die in der Matrix der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert ist, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym, das die Reaktion zwischen Acetyl-Coenzym A und Oxalessigsäure zur Bildung von Citrat katalysiert, dem ersten Schritt des Zitronensäurezyklus.

Um die Citratsynthase-Aktivität zu analysieren, übertragen Sie adulte Drosophila-Fliegen-Thoraxe, die in Mitochondrien reichlich vorhanden sind, in ein Röhrchen, das mit einem gekühlten Extraktionspuffer gefüllt ist, der Ethylendiamintetraessigsäure, EDTA und ein nichtionisches Detergens enthält.

Homogenisieren Sie das Thoraxgewebe auf Eis, um eine hitzevermittelte Proteindenaturierung zu verhindern. Die aufgebrachte Scherkraft in Verbindung mit den Reinigungsmitteln lysiert das Gewebe und setzt intrazelluläre Bestandteile, einschließlich der Mitochondrien, frei.

Darüber hinaus führt der Bruch der inneren Mitochondrienmembran zur Freisetzung von mitochondrialen Matrixproteinen, einschließlich Citratsynthase. EDTA bindet an zweiwertige Kationen und hemmt die Proteaseaktivität, wodurch der Proteinabbau verhindert wird.

Das Homogenat wird mit Extraktionspuffer verdünnt und ein geeignetes Volumen