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Biologische Techniken
0 Ansichten • 3:44 Min. • July 8th, 2025
In den Mitochondrien ist die Citratsynthase, die in der Matrix der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert ist, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym, das die Reaktion zwischen Acetyl-Coenzym A und Oxalessigsäure zur Bildung von Citrat katalysiert, dem ersten Schritt des Zitronensäurezyklus.
Um die Citratsynthase-Aktivität zu analysieren, übertragen Sie adulte Drosophila-Fliegen-Thoraxe, die in Mitochondrien reichlich vorhanden sind, in ein Röhrchen, das mit einem gekühlten Extraktionspuffer gefüllt ist, der Ethylendiamintetraessigsäure, EDTA und ein nichtionisches Detergens enthält.
Homogenisieren Sie das Thoraxgewebe auf Eis, um eine hitzevermittelte Proteindenaturierung zu verhindern. Die aufgebrachte Scherkraft in Verbindung mit den Reinigungsmitteln lysiert das Gewebe und setzt intrazelluläre Bestandteile, einschließlich der Mitochondrien, frei.
Darüber hinaus führt der Bruch der inneren Mitochondrienmembran zur Freisetzung von mitochondrialen Matrixproteinen, einschließlich Citratsynthase. EDTA bindet an zweiwertige Kationen und hemmt die Proteaseaktivität, wodurch der Proteinabbau verhindert wird.
Das Homogenat wird mit Extraktionspuffer verdünnt und ein geeignetes Volumen in das Reaktionsgemisch gegeben, das die Vertiefungen der Multiwell-Platte enthält. Das Reaktionsgemisch besteht aus Acetyl-Coenzym A, Oxalessigsäure und Dithionitrobenzoesäure.
Die Citratsynthase im Homogenat katalysiert die Reaktion zwischen Oxalessigsäure und Acetyl-Coenzym A, wobei Citrat und Coenzym A mit einer Thiolgruppe gebildet werden. Die Thiolgruppe reagiert mit der farblosen Dithionitrobenzoesäure unter Bildung eines gelben Produkts, der Thionitrobenzoesäure.
Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Absorption der gelb gefärbten Lösung. Die Absorption könnte mit der Citratsynthase-Aktivität im Gewebehomogenat zusammenhängen.
10 adulte Fliegenthoraxes sofort in 100 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer umfüllen und mit einem Stößel auf Eis homogenisieren. Halten Sie die Proben kalt, indem Sie sie fünf bis 10 Sekunden lang auf Eis homogenisieren, fünf Sekunden lang auf Eis ruhen lassen und dann den Vorgang wiederholen, bis alle Gewebe vollständig homogenisiert sind.
Aliquotieren Sie 10 Mikroliter jeder homogenisierten Probe in ein neues Röhrchen zur Messung des Proteingehalts, wobei diese Röhrchen ebenfalls auf Eis bleiben. Geben Sie 400 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer zu jeder verbleibenden Probe, um ein Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern zu erhalten, und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um zu mischen.
Für jede Reaktion wird 1 Mikroliter verdünntes Zelllysat zu 150 Mikrolitern der frisch zubereiteten Reaktionslösung gegeben. Mischen Sie gründlich, indem Sie vorsichtig pipettieren, und achten Sie darauf, Blasenbildung zu vermeiden. Verwenden Sie dann ein Plattenlesegerät, um die Absorption bei 412 Nanometern alle 10 bis 30 Sekunden für vier Minuten bei 25 Grad Celsius zu messen.
Stellen Sie die Daten als Absorption über die Zeit dar und berechnen Sie dann die Steigung für den linearen Teil der Kurve. Teilen Sie schließlich die Reaktionsgeschwindigkeit oder Steigung durch die Proteinkonzentration der Probe, um die Citratsynthaseaktivität zu normalisieren.