JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 3:03 Min. • July 8th, 2025
Im Gewebe existiert Eisen, ein essentieller Mineralstoff, der für verschiedene Stoffwechselprozesse von entscheidender Bedeutung ist, normalerweise in Form von Hämoproteinen und Nicht-Häm-Eisenproteinen. Hämoproteine umfassen Eisen- oder Häm-Eisen, das an Porphyrinringe gebunden ist, während Nicht-Häm-Eisen-Proteine die Porphyrin-Ringstruktur fehlen und hauptsächlich Eisen oder Nicht-Häm-Eisen enthalten.
Um den Nicht-Häm-Eisengehalt im Lebergewebe von Mäusen abzuschätzen, behandeln Sie ein getrocknetes, geerntetes Lebergewebefragment der Maus mit niedrigen Konzentrationen von Salzsäure und Trichloressigsäure. Inkubieren Sie bei hohen Temperaturen, um das Gewebe zu verdauen und die säureinduzierte Proteinfällung zu erleichtern.
Aufgrund der niedrigen Säurekonzentrationen wird Nicht-Häm-Eisen aus den zugehörigen Proteinen freigesetzt. Häm-Eisen, das an den Porphyrinring gebunden ist, bleibt davon unberührt.
Nach dem Abkühlen wird das gewünschte Volumen des Überstands, der Nicht-Häm-Eisen enthält, in eine Multi-Well-Platte überführt. Den chromogenen Eisenchelator, Bathophenanthrolinsulfonat, BPS, ergänzt mit Thioglykolsäure, einem Reduktionsmittel, in einen geeigneten Puffer geben und inkubieren.
Thioglykolsäure reduziert das gesamte Eisen(III)-Nicht-Häm-Eisen zu Eisen, das sich leicht im Verhältnis 1:3 an BPS binden kann und einen hochstabilen, rosafarbenen Komplex bildet. Darüber hinaus verhindert Thioglykolsäure Interferenzen durch kontaminierende zweiwertige Metallkationen wie Kupfer, die mit BPS interagieren können.
Legen Sie die Multi-Well-Platte in ein Mikroplatten-Reader, um die Absorption der rosa Eisen-BPS-Komplexe zu messen, die für die Nicht-Häm-Eisenkonzentration im Lebergewebefragment der Maus repräsentativ sind.
Übertragen Sie jedes getrocknete Gewebestück in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 1 Milliliter des Säuregemisches in das Röhrchen und schließen Sie es. Bereiten Sie auf die gleiche Weise einen Säurerohling vor, nur dass das Gewebe hier weggelassen wird.
Inkubieren Sie die Röhrchen 20 Stunden lang bei 65 Grad Celsius, um das Gewebe zu verdauen.
Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden mit einer Mikropipette mit Kunststoffspitzen 500 Mikroliter des klaren Säureextrakts in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Bereiten Sie Chromogenreaktionen direkt in die klaren, unbehandelten Polystyrol-Mikroplatten mit flachem Boden und 96 Wells vor. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Messen Sie die Probenabsorption in einem Plattenlesegerät bei einer Wellenlänge von 535 Nanometern gegen eine Referenz für deionisiertes Wasser.