Sphärisch gestützter Lipid-Doppelschicht-Assay: Eine Technik zur Beobachtung der Septin-Assemblierung auf Mikrosphären

Septine sind wichtige Proteine des Zytoskeletts, die an gekrümmte Plasmamembranoberflächen binden.

Um die In-vitro-Septin-Assemblierung auf Mikrosphären zu beobachten, nehmen Sie zunächst eine Suspension aus gleichmäßig großen, mikroskopisch kleinen Siliziumdioxidkügelchen, die als fester Träger für die Doppelschichtbildung dienen. Wirbeln Sie diese Suspension ein, um alle Perlencluster zu brechen.

Ergänzen Sie es mit kleinen einlamellären Vesikel, SUVs - kugelförmigen Vesikel, die von einer einzigen Lipiddoppelschicht umgeben sind. Inkubieren Sie unter ständigem Rühren, um das Absetzen von Mikrokügelchen zu verhindern.

Während der Inkubation erleichtern die äußeren polaren Kopfgruppen die Adsorption von SUVs an der Oberfläche der hydrophilen Mikrosphäre. Diese Wechselwirkung führt zum Bruch von SUVs, gefolgt von der Fusion von SUV-Lipiden auf der gekrümmten Mikrosphärenoberfläche als durchgehende Schicht, was zur Bildung einer kugelförmigen, gestützten Lipiddoppelschicht, SLB, führt.

Waschen, um überschüssige ungebundene Lipide zu entfernen, und in Reaktionspuffer resuspendieren. Die kugelförmige SLB-Suspension wird auf einen kleinen Bereich einer mit Polyethylenglykol beschichteten Oberfläche übertragen, um unspezifische Adsorptionen zu verhindern. Geben Sie eine fluoreszenzmarkierte Septinsuspension in die Kammer und inkubieren Sie.

Septine bilden Hetero-Oligomere, die die positive Krümmung von sphärischen SLBs erkennen und zu Filamenten polymerisieren. Schließlich interagieren Septinfilamente miteinander, was zur Bildung von Strukturen höherer Ordnung führt.

Beobachten Sie septinbeschichtete SLBs unter einem hochauflösenden Fluoreszenzmikroskop. Das Vorhandensein von Fluoreszenz deutet auf eine krümmungsempfindliche Ablagerung von Septin hin.

Zuerst die Flasche mit den Kieselsäure-Mikrokügelchen 15 Sekunden lang vortexen. Dann eine Minute lang mit einem Bad beschallt und erneut 15 Sekunden lang vortexen, um alle Cluster zu brechen. Mischen Sie die Kügelchen mit SLBB und 10 Mikrolitern 5-Millimolar-SUVs in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adhäsion.

Inkubieren Sie das Kügelchen-Lipid-Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker, um eine Sedimentation zu verhindern. Tauen Sie in der Zwischenzeit ein PEGyliertes Deckglas auf und kleben Sie ein geschnittenes 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen darauf. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Kügelchen 30 Sekunden lang bei der dafür vorgesehenen RCF.

Nach dem ersten Schleudern 50 Mikroliter Überstand entfernen. Fügen Sie dann 200 Mikroliter PRB hinzu und mischen Sie es durch kräftiges Pipettieren. Für die nächsten Runden entfernst du 200 Mikroliter PRB und fügst nach dem zweiten und dritten Schleudern weitere 200 Mikroliter und nach dem vierten Schleudern 220 Mikroliter PRB hinzu.

Wenn Sie einen Wettbewerbsassay mit mehreren Bead-Größen durchführen, bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie gleiche Volumina jeder Bead-Größe mischen und 29 Mikroliter dieser Bead-Mischung mit 721 Mikrolitern Reaktionspuffer verdünnen. Geben Sie dann 75 Mikroliter verdünnte Kügelchen und 25 Mikroliter des in SSB verdünnten Proteins in die Vertiefungen und mischen Sie.

Wenn Sie Septine im stationären Zustand messen, inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur und nehmen Sie dann entweder eine nahe TIRF- oder eine konfokale Mikroskopie vor.