Protein-Phasentrennungs-Assay: Eine optogenetische Methode zur Mutanten-RNA-bindenden Protein-Phasentrennung in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Nukleäre RNA-bindende Proteine, RBPs, sind multifunktionale Proteine, die aus geordneten Regionen mit gut definierter, dreidimensionaler Struktur und weniger stabilen, intrinsisch ungeordneten Regionen, IDRs, bestehen.

Bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen führen IDR-spezifische Mutationen dazu, dass sich RBPs im Zytoplasma fehllokalisieren und aberrant schwache Wechselwirkungen eingehen, wodurch dynamische, membranlose Einschlüsse gebildet werden - ein Phänomen, das als Phasentrennung bezeichnet wird. Schließlich reifen diese Einschlüsse zu toxischen, unlöslichen Aggregaten heran, was zu neuronaler Dysfunktion und Degeneration führt.

Um die RBP-Phasentrennung in vivo mit Hilfe der Optogenetik zu untersuchen, beginnen wir mit einer anästhesierten, dechorionierten transgenen Zebrafischlarve, die ein IDR-mutiertes RBP exprimiert, das mit einem fluoreszierenden Reporter und einer blaulichtempfindlichen Photorezeptordomäne in geeignetem Puffer fusioniert ist.

Montieren Sie als Nächstes die Larve seitlich auf einen geschmolzenen Agarosetropfen für die Bildgebung des Rückenmarks. Lassen Sie die Agarose sich verfestigen und die Larve immobilisieren. Nehmen Sie mit einem konfokalen