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Biologische Techniken
0 Ansichten • 4:08 Min. • July 8th, 2025
Unter Angiogenese versteht man die Bildung neuer Blutgefäße aus den bestehenden Blutgefäßen während entwicklungsbedingter und pathologischer Zustände. Eine umfassende Kommunikation zwischen den Endothelzellen, die die innere Oberfläche der Blutgefäße auskleiden, und den umgebenden Perizyten - unterstützenden Zellen an der Außenseite der Blutgefäße - ist entscheidend für die Angiogenese.
Um die In-vitro-Angiogenese zu untersuchen, beginnen Sie mit Endothelzellen und mit Perizyten beschichteten Microcarrier-Kügelchen, die in einer Fibrinogenlösung suspendiert sind - einem löslichen Glykoprotein, das als Fibrinvorläufer fungiert.
Pipettieren Sie nun die Bead-Suspension in eine Kulturplatte, die eine Lösung von Thrombin - einem proteolytischen Enzym - enthält, und inkubieren Sie. Thrombin bindet an das Fibrinogenmolekül, wodurch seine Spaltung unlösliche Fibrinmonomere bildet, wodurch polymeres Fibringel entsteht. Dieser Schritt sorgt für die Einbettung von zellbeschichteten Kügelchen in das Fibringel.
Als nächstes wird eine Kultur von Fibroblasten - Vorläuferzellen des Bindegewebes - auf das Fibringel aufgetragen und inkubiert, um die Aktivierung der Fibroblasten zu ermöglichen.
Während der Inkubation sezernieren die Fibroblasten entscheidende angiogene Wachstumsfaktoren, die die Aktivierung der Endothelzellen auslösen. In Kombination sezernieren adhärente Perizyten und Endothelzellen Signalmoleküle, die beim Sprossen von Endothelzellen im Fibringelgel helfen.
Die Endothelsprossen erscheinen als mit Perizyten umhüllte längliche Zellvorsprünge, die das frühe Stadium der Angiogenese darstellen.
Untersuchen Sie die Schalen von Microcarrier-beschichteten Kügelchen unter dem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung, um zu bestätigen, dass alle Kügelchen ausreichend von den Endothelzellen beschichtet wurden.
Übertragen Sie die Platten in eine Laminar-Flow-Haube und verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die beschichteten Kügelchenlösungen kräftig abzusaugen und zu dosieren, um die Zellen von den Plattenböden zu lösen und die Überstände in einzelne Röhrchen zu übertragen.
Lassen Sie die Kügelchen drei Minuten lang auf dem Boden der Röhrchen absetzen. Verwenden Sie dann die P1000-Pipette, um so viele Überstände wie möglich zu entfernen, ohne die Kügelchencluster zu stören. Resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter vollständigem Medium pro Tube und lassen Sie die Kügelchen 30 bis 60 Sekunden lang absetzen. Verwenden Sie die P1000-Pipette, um den Überstand erneut zu aspirieren, und waschen Sie die frei schwebenden Endothelzellen aus der Bead-Suspension mit frischem vollständigem Medium, zwei weitere Male, wie gerade gezeigt.
Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Kügelchen in 2,5 Millilitern Fibrinogenlösung. Geben Sie 13 Mikroliter Thrombinlösung pro Vertiefung in eine 24-Well-Glasbodenplatte. Geben Sie dann 0,5 Milliliter der Kügelchen-/Fibrinogenlösung in jede Vertiefung, achten Sie darauf, die Kügelchen vorsichtig direkt in das Thrombin zu pipettieren, und pipettieren Sie langsam zwei- bis dreimal auf und ab, um die Lösungen gründlich zu mischen.
Wenn alle Vertiefungen ausgesät sind, lassen Sie die Thrombin-Fibrinogen-Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Laminar-Flow-Haube vorgerinnen. Übertragen Sie die Platte am Ende der Inkubation vorsichtig für weitere 1,5 bis 2 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.
Wenn das Gel vollständig erstarrt ist, resuspendieren Sie normale menschliche Lungenfibroblasten in einer Konzentration von 2 x 104 Zellen pro Milliliter in vollständigem Medium und fügen Sie jeweils einen Milliliter Fibroblasten hinzu. Stellen Sie die Platte dann wieder in den Zellkultur-Inkubator.