Topischer Test-Assay: Eine Technik zur Bewertung des insektiziden Potenzials von Dopaminrezeptor-Antagonisten bei erwachsenen weiblichen Mücken durch topische Anwendung

Der topische Testtest bei Stechmücken hängt von der direkten Ablagerung eines Wirkstoffs auf dem dorsalen Thorax erwachsener Mücken ab, um seine insektizide Eigenschaft zu testen.

mit der Betäubung erwachsener weiblicher Mücken, indem Sie sie dem kritischen thermischen Minimum aussetzen - einer niedrigen Temperatur, die ihre neuromuskuläre Aktivität stoppt.

Legen Sie einzelne betäubte weibliche Mücken unter ein Präpariermikroskop. Nehmen Sie eine mit einem Mikroapplikator verbundene Glasspritze, die mit der Testverbindung - einem Dopaminrezeptorantagonisten - in einem unpolaren Lösungsmittel gefüllt ist. Positionieren Sie die Nadel in der Nähe des Thorax und verwenden Sie den Mikroapplikator, um vorsichtig einen Tropfen der Testverbindung auf die dorsale Oberfläche aufzutragen.

Bringen Sie die behandelten Mücken nach der Anwendung für einen bestimmten Zeitraum in eine Wachstumskammer mit kontrollierten Umgebungsbedingungen.

Das unpolare Lösungsmittel im Tröpfchen löst Lipide in der Kutikula - einer äußeren Hülle - auf, so dass die Verbindung in das Innere eindringen kann. Die Verbindung diffundiert durch die darunter liegende Epidermisschicht und erreicht die thorakalen Ganglien - eine dichte Gruppe von Nervenzellen, die mit dem Nervensystem verbunden sind.

Auf dem Weg in die Nervenzellen bindet die Verbindung an eine allosterische Stelle – eine zusätzliche Bindungsstelle für regulatorische Moleküle – auf dem Dopaminrezeptor. Die allosterische Bindung behindert die nachgeschaltete Signalkaskade bei der Bindung an Dopamin - einen Neurotransmitter, der kritische biologische Prozesse steuert - und führt zum Tod.

Im Anschluss an die Versuchsdauer ist die Anzahl der toten Mücken - behandelte Individuen, die sich nicht bewegen - zu erfassen, um das insektizide Potenzial des Testmittels zu beurteilen.

Züchten Sie 3 bis 5 Tage alte erwachsene weibliche Mücken in einem 20-Liter-Plastikkäfig. Beschriften Sie 9-Unzen-Pappbecher mit dem Namen und der Konzentration der Testverbindung.

Bereiten Sie anschließend eine 10 μg/μl Stammlösung der Testverbindung in Aceton in einem 20-Milliliter-Glasfläschchen vor. Verdünnen Sie dann die Stammlösung seriell, um die gewünschten Arbeitskonzentrationen zu erhalten.

Reinigen Sie eine 1-Milliliter-Glasspritze mit Aceton und füllen Sie sie dann mit der Testlösung in der entsprechenden Konzentration. Sichern Sie die Spritze in einem Mikroapplikator, der so eingestellt ist, dass er ein Volumen von 0,25 Mikrolitern abgibt.

Als nächstes nehmen Sie mit einem Sauger zehn 3 bis 5 Tage alte erwachsene weibliche Mücken aus dem Käfig und betäuben sie 5 Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Bringen Sie dann die Mücken in eine Petrischale und stellen Sie die Schale 10 Minuten lang auf Eis.

Um Schäden an der erwachsenen Mücke zu vermeiden, die zur Sterblichkeit beitragen könnten, stellen Sie sicher, dass sie nicht länger als 5 Minuten im Kühlschrank betäubt oder länger als 10 Minuten auf Eis immobilisiert werden, und minimieren Sie den Umgang mit den Mücken. Wenn Sie Zugang zu einer Kühlplatte und einem Mikromanipulator mit beweglichem Tisch haben, kann dies den Umgang mit den Mücken weiter minimieren.

Verwenden Sie eine feine Pinzette, um jede Mücke aus der Schüssel zu entfernen. Tragen Sie mit dem Mikroapplikator der Spritze 0,25 Mikroliter Testlösung unter einem Präpariermikroskop auf den dorsalen Thorax auf. Als nächstes gibst du die Mücken in einen beschrifteten Pappbecher auf Eis. Verschließen Sie den Becher mit einem 10 x 10 Zentimeter großen Maschenquadrat und einem Gummiband. Übertragen Sie es dann in die Wachstumskammer und notieren Sie die Anzahl der toten Mücken.