JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 4:38 Min. • July 8th, 2025
Endotoxin, ein gramnegatives bakterielles Toxin, das auf der äußeren Membran vorhanden ist, ist ein Lipopolysaccharid, LPS, das hauptsächlich aus Lipiden und Polysacchariden, einschließlich Lipid A und O-Antigen, besteht. Wenn es während der Infektion freigesetzt wird, wird es vom Immunsystem erkannt und löst zytokinbasierte Entzündungsreaktionen aus.
Zur Abschätzung der Endotoxinkontamination in einer liposomalen Arzneimittel-Nanoformulierung unter Verwendung des Limulus-Amöbozytenlysats, LAL-Assays, bereiten Sie Reaktionsröhrchen vor, eines mit dem Arzneimittel und das andere mit dem Arzneimittel, das mit einer bekannten Endotoxinkonzentration versetzt ist.
Fügen Sie ein LAL-Reagenz hinzu, das Proteinlysat enthält, das aus Pfeilschwanzkrebsen, Limulus-Polyphem, Blutzellen oder Amöbozyten gewonnen wird. Das Lysat enthält inaktive Serinproteasen - Faktor B, Faktor C, Prochrominnungsenzym - und ein Gelgerinnungsprotein, Koagulogen.
Wirbeln Sie die Röhrchen und laden Sie sie in ein Trübungsmessgerät, um die Trübung der Lösungen zu messen.
In Gegenwart von kontaminierendem LPS, das an liposomale Arzneimittel gebunden ist, wird der LPS-empfindliche Faktor C autokatalytisch aktiviert, der dann den Faktor B spaltet und aktiviert, der das gerinnungsfördernde Enzym in ein gerinnungsförderndes Enzym umwandelt. Dieses aktivierte Enzym spaltet die Coagulogen-Peptidbindungen und bildet Koagulinmonomere.
Schließlich polymerisieren die Monomere über Wechselwirkungen zwischen den freiliegenden hydrophoben Bereichen am Kopf und dem hydrophoben Schwanz des anderen, was zur Aggregation und Bildung von unlöslichem trübem Koagulingel führt. Die gemessene Trübung hilft bei der Bestimmung der Endotoxinkonzentration in der Nanoformulierung.
Die berechnete Spike-Wiederfindung aus den Endotoxinkonzentrationen in den Spike- und Testproben innerhalb des akzeptablen Bereichs deutet auf keine größere Interferenz durch die Nanoformulierung hin, was das Vorhandensein von Endotoxinen in dem nanoformulierten Arzneimittel bestätigt.
Verwenden Sie für die Herstellung des Kalibrierstandards 900 Mikroliter Limulus Amöbozytenlysat oder Wasser in LAL-Qualität und 100 Mikroliter Kontrollstandard-Endotoxin, um so viele Zwischenverdünnungen wie nötig herzustellen, um die Herstellung eines Kalibrierstandards mit einer Konzentration von einer Endotoxineinheit pro Milliliter zu ermöglichen.
Bereiten Sie dann unter Verwendung von 900 Mikrolitern Wasser in LAL-Qualität und 100 Mikrolitern des Endotoxin-Einheit pro Milliliter-Kalibrierstandard einen zweiten Kalibrierstandard mit einer Konzentration von 0,1 Endotoxin-Einheit pro Milliliter vor.
Wiederholen Sie dann die serielle 10-fache Verdünnung, um zwei niedrigere Kalibrierstandards herzustellen, um insgesamt vier Kalibrierstandards im Bereich von 0,001 bis 1 Endotoxineinheit pro Milliliter zu erhalten.
Um eine Qualitätskontrolle von 0,05 Endotoxineinheiten pro Milliliter herzustellen, kombinieren Sie 50 Mikroliter einer Endotoxineinheit pro Milliliter der Standard-Endotoxinlösung mit 950 Mikrolitern Wasser in LAL-Qualität.
Wählen Sie anschließend in der Software die "Instrumenteneinstellungen" aus und erstellen Sie die Vorlage. Wählen Sie "Daten sammeln" und geben Sie die Test-ID und die Datengruppe auf der Registerkarte "Allgemein" ein. Wählen Sie auf der Registerkarte "Hardware" den Gerätetyp und die LAL-Methode aus und stellen Sie sicher, dass eine Seriennummer, die System-ID und die Informationen zur seriellen Schnittstelle auf dem Bildschirm angezeigt werden.
Klicken Sie zweimal auf "OK", um die Geräteauswahl und die Kommunikation mit dem Gerät zu bestätigen, und geben Sie die Proben-IDs in der gleichen Reihenfolge ein, in der die Proben getestet werden. Verwenden Sie dann die Standardtasten, um die Negativkontrolle, die Normkurve und die Prüfmuster einzugeben.
Geben Sie das entsprechende Volumen der Negativkontroll-Kalibrierstandards und der Qualitätskontrolle in doppelt vormarkierte Glasröhrchen und geben Sie das entsprechende Volumen LAL in das erste Testfläschchen. Drehen Sie das Fläschchen kurz vor und setzen Sie das Fläschchen in die entsprechenden Testschlitze im Instrumentenkarussell ein.
Vor dem Laden der Proben sind mehrere Verdünnungen des Test-Nanomaterials innerhalb der maximal gültigen Verdünnung durchzuführen, wie gezeigt.