JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 3:27 Min. • July 8th, 2025
Biomasse ist eine pflanzliche organische Substanz, die hauptsächlich aus komplexen Polysacchariden besteht. Kohlenhydratabbauende Enzyme wirken auf diese Polysaccharide, um kleinere Oligosaccharide zu produzieren.
Um die Abbauaktivität eines Enzyms zu bewerten, beginnen Sie mit der Entnahme verschiedener unlöslicher chromogener Biomasse - ICB-Substrate, die in den Vertiefungen einer porösen Reaktionsplatte vorhanden sind. Diese Substrate werden durch das Färben pflanzlicher Materialien mit einem bestimmten Farbstoff Chlortriazin gewonnen. Die resultierende Biomasse weist farbstoffmarkierte komplexe Polysaccharide auf, die als Substrat für die Enzymaktivität dienen.
Fügen Sie nun eine Pufferlösung hinzu, die ein kohlenhydrathydrolysierendes Enzym enthält. Der Puffer hält den pH-Wert für eine optimale Enzymaktivität aufrecht. Stellen Sie die Reaktionsplatte auf einen Schüttler und inkubieren Sie. Durch ständiges Rühren können die Enzymmoleküle das Zielpolysaccharid im ICB-Substrat erreichen.
Während der Inkubation spaltet das hydrolysierende Enzym kovalente glykosidische Bindungen innerhalb der langkettigen Polysaccharide. Bei der Reaktion entstehen lösliche Oligosaccharide, die an Farbstoffmoleküle gebunden sind und in der Lösung verbleiben.
Nach Abschluss der Zerlegung legen Sie die Reaktionsplatte auf eine Produktplatte und zentrifugieren Sie die Baugruppe. Während der Zentrifugation passiert die farbige Lösung, die Reaktionsprodukte enthält, den Filter am Boden der Platte und wird in der Produktplatte gesammelt. Mit einem Plattenlesegerät ist die Absorption des Überstands aufzuzeichnen.
Ein höherer Absorptionswert bedeutet die Bildung einer großen Anzahl von farbstoffgebundenen Oligosacchariden - was auf die Effizienz des Enzyms beim Abbau des ICB-Substrats hinweist.
Um den chromogenen Assay mit roter unlöslicher chromogener Biomasse oder ICB-Weizenstroh durchzuführen, beginnen Sie mit der Zugabe von 200 Mikrolitern Aktivierungslösung in jede Vertiefung der Assay-Platte. Dann die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Rühren inkubieren.
Entfernen Sie den Stabilisator, indem Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern sterilem Wasser waschen. Fügen Sie dann 150 Mikroliter 100-Millimolar-Natriumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 und 5 Mikroliter mit 10 Einheiten pro Milliliter verschiedener Endo-Xylanase-Lösung hinzu.
Positionieren Sie die Produktplatte unter der Substratplatte, um mögliche Leckagen von der Substratplatte während des Schüttelns aufzufangen, und inkubieren Sie die Reaktion 2 Stunden lang bei Raumtemperatur und 100 U/min.
Legen Sie nach der Inkubation die Platte des Assay-Kits mit der Produktplatte darunter in die Zentrifuge und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 2.700 x g, um das Reaktionsprodukt in die Vertiefungen der Produktplatte zu übertragen.
Vergewissern Sie sich, dass das Flüssigkeitsvolumen in jeder Vertiefung ungefähr gleich ist. Anschließend wird mit einem Plattenlesegerät die Absorption der Auffangplatte bei 517 Nanometern für rotes ICB-Weizenstroh abgelesen.