Differential Nuclear Staining Assay: Ein Assay zur Bestimmung der Mitokan-Zytotoxizität durch Propidiumiodid und Hoechst-Doppelfärbung

Mitocane sind eine Klasse von Medikamenten, die selektiv die Funktion der Mitochondrien in Krebszellen beeinflussen und Apoptose induzieren.

Um die Zytotoxizität von Mitokanen zu bestimmen, säen Sie eine Zellsuspension mit semi-adhärenten Krebszellen auf eine Multiwell-Platte. Behandeln Sie die Platte mit der gewünschten Mitocan-Lösung und inkubieren Sie.

Mitocan dringt in die Krebszelle ein, um ihre mitochondriale Aktivität zu stören, was schließlich zum Zelltod in Mitocan-empfindlichen Krebszellen führt. Behandeln Sie die Zellen mit einer Färbelösung, die eine Mischung aus Hoechst-Farbstoff und Propidiumiodid enthält.

Hoechst, ein membrandurchlässiger Fluoreszenzfarbstoff, dringt in alle Zellen ein und bindet an den AT-reichen Bereich ihrer DNA, wodurch die Zellkerne lebender und toter Zellen mit einer blauen Fluoreszenz versorgt werden.

Im Gegensatz dazu gelangt Propidiumiodid, ein membranundurchlässiger Fluoreszenzfarbstoff, ausschließlich durch die geschädigten Teile ihrer Membranen in die toten Zellen. Der Farbstoff interkaliert zwischen den DNA-Basen und verleiht den abgestorbenen Zellen eine zusätzliche rote Fluoreszenz. Das Vorhandensein beider Farbstoffe in den Zellkernen dieser Zellen lässt die toten Zellen violett erscheinen.

Zentrifugieren Sie die Platte mit niedriger Geschwindigkeit, um die Zellen abzusetzen und die Genauigkeit während der Bildgebung zu erhöhen. Nehmen Sie das Bild unter einem Fluoreszenzmikroskop auf und beobachten Sie zwei verschiedene Zellpopulationen. Zählen Sie die Anzahl beider Zellentypen.

Der prozentuale Anteil der violetten Blutkörperchen, die die tote Population repräsentieren, im Vergleich zur Gesamtpopulation zeigt das zytotoxische Potenzial des Testmitocans an.

Beginnen Sie mit der Herstellung von Lösungen der interessierenden Verbindungen in der gewünschten Konzentration. Achten Sie immer darauf, die Verbindungen durch gründliches Vortexen zu mischen.

Um die Zytotoxizität einer einzelnen Verbindung zu messen, bereiten Sie Verbindungen in einer 2-fachen Endkonzentration vor. Bei der Messung der Zytotoxizität von Verbindungskombinationen sind diese in einer 4-fachen Endkonzentration herzustellen.

Bereiten Sie reine Lösungsmittelkontrollen vor, indem Sie die gleiche Menge Lösungsmittel mit dem entsprechenden Medium mischen. Sammeln Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und aliquotieren Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension für die Trypanblau-Färbung. Geben Sie 10 Mikroliter 0,4 % Trypanblau zum Aliquot und verwenden Sie ein Hämozytometer oder einen Zellzähler, um lebensfähige und nicht lebensfähige Zellen zu zählen.

Pelletzellen in das 15-Milliliter-Röhrchen bei 200 x g für 5 Minuten geben, dann den Überstand aspirieren oder dekantieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Assay-geeigneten Medium bei einer Zelldichte von 3x10⁵ Zellen pro Milliliter. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte zu säen.

Für Einzelverbindungs-Assays geben Sie 50 Mikroliter 2X Verbindungslösung in jede Vertiefung. Für Vertiefungen zur Lösungsmittelkontrolle fügen Sie 50 Mikroliter Testmedium hinzu, das das Lösungsmittel in einer 2-fachen Konzentration enthält. Für Kombinationsassays geben Sie 25 Mikroliter jeder der 4X-Verbindungen in jede Vertiefung. Bei Kontrollvertiefungen mit einer Verbindung sind jeweils 25 Mikroliter 4X Verbindungslösung und Prüfmedium hinzuzufügen. Es ist darauf zu achten, dass die Endkonzentration von DMSO 0,5 % nicht überschreitet.

Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, fügen Sie Medikamente hinzu, wobei die Pipettenspitze die Seite der Vertiefungen berührt, und achten Sie darauf, die Medikamente an verschiedenen Stellen hinzuzufügen. Dieser Schritt sollte sehr schnell durchgeführt werden, vorzugsweise nicht länger als 30 Minuten pro Platte.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um den Inhalt der Vertiefungen zu mischen, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Wenn Sie bereit sind, die Zellen mit Hoechst 33342 und Propidiumiodid zu färben, bereiten Sie eine frische 10X-Färbelösung vor und geben Sie 10 Mikroliter in jede Vertiefung. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 x g für 4 Minuten, um alle Zellen an den Boden der Platte zu bringen. Wischen Sie dann den Boden der Platte vorsichtig mit einem feuchten Labortuch ab, um Schmutz zu entfernen, der die Bildgebung beeinträchtigen könnte. Stellen Sie die Platte innerhalb von 15 Minuten nach der Zentrifugation dar.