In vitro Glukoseabbau-Assay: Eine fluoreszenzbasierte Methode zur Quantifizierung der zellulären Glukoseaufnahme durch extrazelluläre Glukoseabbaumessung

Glukose, eine primäre zelluläre Energiequelle, gelangt über Glukosetransporterproteine der Zellmembran in die Zellen. Glukose wird im Zytoplasma der Zelle über den glykolytischen Weg zu Pyruvat abgebaut und erzeugt Energie durch Adenosintriphosphat oder ATP für den Zellstoffwechsel.

Um die intrazelluläre Glukoseaufnahme zu messen, beginnen Sie mit einer adhärenten Kultur von Fibroblasten in einer Multi-Well-Platte. Ersetzen Sie das Medium durch glukosefreies Medium und inkubieren Sie. Die Zellen verstoffwechseln die verfügbare Glukose, um Energie zu erzeugen, und erreichen einen Zustand des Glukosemangels.

Ersetzen Sie das Medium in einem Satz Vertiefungen durch glukosefreie Medien, die Insulin, einen Glukoseaufnahmestimulator, und fluoreszierende Desoxyglucose, ein Glukoseanalogon, enthalten. Behandeln Sie einen weiteren Satz Wells mit glukosefreien Medien, die fluoreszierende Desoxyglucose enthalten.

Während der Inkubation stimuliert Insulin die Translokation zusätzlicher Glukosetransporter zur Plasmamembran, was eine erhöhte Aufnahme von fluoreszierender Desoxyglucose in Abwesenheit von Glukose ermöglicht.

Desoxyglucose wird phosphoryliert und von den Zellen nicht weiter verstoffwechselt. Gleichzeitig nimmt die extrazelluläre Konzentration von fluoreszierender Desoxyglucose ab.

Sammeln Sie nach der Inkubation die Medien mit ungenutzter fluoreszierender Desoxyglukose. Behandeln Sie die Zellen mit einem Lysepuffer. Das Detergens im Puffer bildet Mizellen und löst die Zellmembranen auf, wodurch intrazelluläre Inhalte freigesetzt werden.

Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Fluoreszenz des Zellhomogenats, das intrazelluläre fluoreszierende Desoxyglucose enthält, und von Medien, die ungenutzte extrazelluläre fluoreszierende Desoxyglucose enthalten.

Insulin-stimulierte Fibroblasten weisen im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen eine erhöhte intrazelluläre fluoreszierende Desoxyglucoseaufnahme und eine entsprechend verringerte extrazelluläre fluoreszierende Desoxyglucose auf.

Verwenden Sie 8 Replikate für jede Simulationsbedingung. Bereiten Sie daher 1 Milliliter für jede Simulationsbedingung vor.

Verwenden Sie 7 Simulationsbedingungen ohne Insulin: FD-Glukose von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter und 0 Milligramm pro Milliliter in einer 96-Well-Platte.

Verwenden Sie 7 Stimulationsbedingungen mit Insulin: FD-Glukose von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter und 0 Mikrogramm pro Milliliter in einer anderen 96-Well-Platte.

Zur Vorbereitung der Stimulationsbedingungen verdünnen Sie 1 Mikroliter 5 Milligramm pro Milliliter FD-Glukose-Arbeitslösung und 999 Mikroliter glukosefreies DMEM, um 1 Milliliter Arbeitsstofflösung zu erhalten.

Bereiten Sie unter Verwendung dieser Arbeitsstofflösung Verdünnungen von 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 und 1:100.000 FD-Glukose vor, um 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter in 2-Milliliter-Röhrchen unmittelbar vor Experimenten in einer Biosicherheitswerkbank ohne Beleuchtung zu erhalten. Fügen Sie 1 Mikroliter Insulin zu jeder dieser Erkrankungen hinzu.

Nach 40-minütiger Inkubation wird das glukosefreie DMEM aus jeder Vertiefung in 96-Well-Platten umgefüllt und die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern absorbiert. Geben Sie jeweils 100 Mikroliter aus den verschiedenen zuvor beschriebenen Behandlungsbedingungen in die Vertiefungen entlang einer Säule und 100 Mikroliter aus derselben Behandlungsbedingung in die Vertiefungen entlang der Reihe in beiden 96-Well-Platten. Beschriften Sie die Platten, die die Bedingungen verwendet haben, mit und ohne Insulin.

Geben Sie nur glukosefreies DMEM in die Kontrollvertiefungen. Inkubieren Sie die Platte 40 Minuten lang in einem Zellkultur-Inkubator im Dunkeln.

Nachdem die Zellen 40 Minuten lang stimuliert wurden, übertragen Sie die Stimulationsmedien von beiden Platten in neue 96-Well-Platten, wobei das experimentelle Layout beibehalten wird. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Entfernen Sie PBS und füllen Sie die restliche Lösung auf sterile Papiertücher um.

Fügen Sie dem Puffer des Radioimmunpräzipitationsassays einen Proteaseinhibitor hinzu, um Proteine zu schützen. Legen Sie die Platten mit dem Radioimmunpräzipitationsassay für 30 Minuten in einen Shaker.

Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 Nanometern, zuerst in dem Medium, das extrazelluläre FD-Glukose enthält, und dann auf der Platte mit Radioimmunpräzipitationsassay-lysierten Zellen am Ende der 30-minütigen Inkubation.