Messung der extrazellulären fluoreszierenden Glukoseanaloga-Depletion: Eine Surrogat-Messtechnik zur Beurteilung der Glukoseaufnahme in Mausorganen ex vivo

In Geweben gelangt extrazelluläre Glukose durch erleichterte Diffusion durch spezifische Glukosetransporter in die Zellen.

Glukose wird im Zytoplasma der Zelle über die Glykolyse, einen Stoffwechselweg, zu Pyruvat abgebaut, wobei Energie in Form von Adenosintriphosphat oder ATP für zelluläre Stoffwechselprozesse erzeugt wird.

Um die Glukoseaufnahme ex vivo zu messen, beginnen Sie mit frisch geerntetem kleinem Lebergewebe von Mäusen. Fügen Sie einen geeigneten Puffer hinzu, um die physiologischen Bedingungen aufrechtzuerhalten.

Übertragen Sie das Gewebe anschließend auf eine Multiwell-Platte mit glukosefreiem Medium. Anschließend erfolgt eine Inkubation in glukosefreien Medien, die mit Desoxyglucose, einem fluoreszenzmarkierten Glukoseanalogon, ergänzt werden. Die geringe Größe des Gewebes ermöglicht den Eintritt von Desoxyglukose.

Desoxyglukose gelangt durch Glukosetransporter in Abwesenheit von Glukose in die Zellen. In den Zellen durchläuft Desoxyglucose eine Phosphorylierung, wird aber nicht weiter verstoffwechselt, was zu einer Akkumulation führt.

Sammeln Sie die Medien mit ungenutzter fluoreszenzmarkierter Desoxyglukose zu den gewünschten Zeitpunkten. Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Fluoreszenz der extrazellulären Desoxyglukose, die mit der intrazellulären Gewebeaufnahme von Desoxyglukose korreliert werden kann.

Inkubieren Sie das entnommene Gewebe oder die entnommenen Organe eine Minute lang in einer 6-Well-Platte, die PBS enthält. Behandeln Sie jedes Gewebe oder Organ in einer separaten Vertiefung. Legen Sie nach einer Minute jedes Taschentuch auf ein steriles Papiertuch, um PBS aufzunehmen.

Übertragen Sie Gewebe oder Organe in eine separate 6-Well-Platte mit 4.000 Mikrolitern glukosefreiem DMEM und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Nach zwei Minuten wird das Gewebe entnommen und in Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 0,29 millimolaren FD-Glukose-Arbeitslösung überführt. Inkubieren Sie die 6-Well-Platten mit Geweben in FD-Glukose-Arbeitslösung bei 37 Grad Celsius.

Sammeln Sie 100 Mikroliter FD-Glukose-Arbeitslösung aus jeder Vertiefung nach 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten Inkubation und übertragen Sie die gesammelten 100 Mikroliter FD-Glukose-Arbeitslösung in 96-Well-Platten, um die Kinetik des extrazellulären FD-Glukosemangels zu analysieren. Vor und nach der Entnahme schütteln.

Messen Sie die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 bzw. 535 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader.