Der gleitende Aktinfilament-Assay: Ein In-vitro-Motilitätsassay zur Untersuchung der Translokation von Aktinfilamenten auf immobilisierten Myosinen

Myosin - ein Motorprotein - interagiert mit einem anderen filamentösen Protein, Aktin, und verursacht dessen Translokation.

Um die Gleitbewegung von Aktin zu analysieren, wird eine auf Glasobjektträgern basierende Strömungskammer so zusammengebaut, dass der innere Teil des Kammerdeckels mit Nitrozellulose beschichtet ist. Fließen Sie die Myosinproteine durch die Kammer ein, die sich über der Nitrozellulosebeschichtung immobilisieren.

Ergänzen Sie die Kammer mit unmarkierten Aktinfilamenten - schwarzen Aktinen - und fügen Sie einen Motilitätspuffer hinzu, der Adenosintriphosphat oder ATP-Moleküle enthält.

Die Aktinfilamente binden an immobilisierte aktive Myosine zusammen mit inaktiven oder toten Myosinen. ATP-Moleküle interagieren mit den aktiven Myosinen, was zu ihrer Dissoziation von schwarzen Aktinen führt, während die inaktiven Myosine aktingebunden bleiben.

Zentrifuge zur Pelletierung inaktiver Myosine, die an schwarze Aktine gebunden sind. Spülen Sie gründlich mit einem Puffer ab, um das inaktive Myosin-Pellet, freie Aktinfilamente und ungenutzte ATPs zu entfernen. Fluss in fluoreszenzmarkierten Aktinen, die immobilisierte, aktive Myosine binden.

Ergänzen Sie die Kammer mit e