Invertierter Motilitäts-Assay: Eine In-vitro-Technik zur Visualisierung der Myosinbewegung auf immobilisierten Aktinfilamenten

Myosin - ein Motorprotein - hat eine kugelförmige Kopfdomäne, die mit Aktin - einem filamentösen Protein - interagiert. Diese Interaktion ist essentiell für die Translokation von Myosin entlang der Aktinfilamente. Um diese Bindung in vitro zu untersuchen, führen Sie einen invertierten Motilitätsassay von Myosin über oberflächengebundenem Aktin durch.

Bauen Sie zunächst eine Assay-Kammer zusammen, indem Sie ein biotinyliertes Polyethylenglykol-PEG-beschichtetes Deckglas so über einen Objektträger legen, dass die beschichtete Oberfläche nach innen zeigt, wodurch die Oberseite der Kammer entsteht.

Führen Sie eine Lösung, die Avidin - ein Glykoprotein - enthält, durch die Kammer. Avidin bindet mit hoher Affinität an Biotin, was die Aktinadhäsion verbessert. Als nächstes fließen Sie mit Biotin markierte Aktinfilamente ein, die mit einem roten Fluorophor markiert sind. Der Biotin-Ligand bindet an Avidin und immobilisiert die Filamente auf der Deckglasoberfläche.

Fügen Sie schließlich grün fluoreszierende, proteinmarkierte Myosin-5A-Proteine in einen Puffer hinzu, der Adenosintriphosphat- oder ATP-Moleküle enthält. Das zweiköpfige Myosin 5A, das einen nachlaufenden und einen führenden Kop