Differentielle radiale Kapillarwirkung des Liganden-Assays: Eine Hochdurchsatztechnik zur Identifizierung von bakteriellen Nukleotid-Second-Messenger-bindenden intrazellulären Proteinen

Bakterien produzieren Nukleotid-Botenstoffe, NSMs - intrazelluläre Signalmoleküle - als Reaktion auf entsprechende Reize. Diese Moleküle binden an Zielproteine und regulieren bakterielle Funktionen.

Um diese Zielproteine unter Verwendung der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays zu identifizieren, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit bakteriellem Zelllysat, das lösliche Proteine enthält. Diese Proteine werden von verschiedenen bakteriellen Klonen abgeleitet, die einzelne ORFs - offene Leserahmen - im Genom exprimieren, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung ein eindeutiges Protein enthält.

Fügen Sie eine Mischung aus Guanosin-, Tetra- und Pentaphosphaten - NSMs hinzu, die mit radioaktivem Phosphor markiert sind. Diese Moleküle binden an Zielproteine im Lysat. Sammeln Sie mit einem Stiftwerkzeug die gleiche Menge Flüssigkeit aus jeder Vertiefung. Legen Sie das Werkzeug auf eine Nitrozellulosemembran, um die Flüssigkeit als Flecken abzulagern.

Zielproteine binden durch nicht-kovalente Wechselwirkungen an die Membran und verhindern so ihre Diffusion. Dadurch werden die gebundenen radioaktiv markierten NSM am zentralen Applikationspunkt sequestriert. Freie NSM