Differentielle radiale Kapillarwirkung des Liganden-Assays: Eine Hochdurchsatztechnik zur Identifizierung von bakteriellen Nukleotid-Second-Messenger-bindenden intrazellulären Proteinen

Bakterien produzieren Nukleotid-Botenstoffe, NSMs - intrazelluläre Signalmoleküle - als Reaktion auf entsprechende Reize. Diese Moleküle binden an Zielproteine und regulieren bakterielle Funktionen.

Um diese Zielproteine unter Verwendung der differentiellen radialen Kapillarwirkung des Ligandenassays zu identifizieren, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte mit bakteriellem Zelllysat, das lösliche Proteine enthält. Diese Proteine werden von verschiedenen bakteriellen Klonen abgeleitet, die einzelne ORFs - offene Leserahmen - im Genom exprimieren, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung ein eindeutiges Protein enthält.

Fügen Sie eine Mischung aus Guanosin-, Tetra- und Pentaphosphaten - NSMs hinzu, die mit radioaktivem Phosphor markiert sind. Diese Moleküle binden an Zielproteine im Lysat. Sammeln Sie mit einem Stiftwerkzeug die gleiche Menge Flüssigkeit aus jeder Vertiefung. Legen Sie das Werkzeug auf eine Nitrozellulosemembran, um die Flüssigkeit als Flecken abzulagern.

Zielproteine binden durch nicht-kovalente Wechselwirkungen an die Membran und verhindern so ihre Diffusion. Dadurch werden die gebundenen radioaktiv markierten NSM am zentralen Applikationspunkt sequestriert. Freie NSM diffundieren radial mit der flüssigen Phase durch Kapillarwirkung.

Verwenden Sie die Phosphor-Bildgebung, um die radioaktiven Signale zu erkennen und ein digitales Bild der Flecken zu erhalten. Definieren Sie die Punkte mit zwei Kreisen. Das äußere Bild stellt die Peripherie der diffusen NSM dar. Der innere Kreis stellt die sequestrierten NSMs dar.

Berechnen Sie die Bindungsfraktion - die Intensität der Radioaktivität, die vom inneren Kreis über die Gesamtradioaktivität des diffusen Spots erfasst wird. Lokalisieren Sie Spots mit hohen Bindungsfraktionen, um die Wells mit NSM-gebundenen Zielproteinen zu identifizieren.

Für das DRaCALA-Screening der Zielproteine geben Sie 20 Mikroliter der aufgetauten Ganzzelllysate in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-V-Boden-Mikrotiterplatte und fügen Sie 2,5 Einheiten Serratia marcescens Endonuklease in jede Vertiefung hinzu. Nach 15 Minuten bei 37 Grad Celsius die Lysate für 20 Minuten auf Eis legen.

Mischen Sie als nächstes gleiche Volumina von Phosphor-32-markiertem Guanosinpentaphosphat und Guanosintetraphosphat und fügen Sie der Mischung 1x Lysepuffer #1 hinzu, um eine viernanomolare Guanosinpentaphosphatlösung zu erhalten.

Mischen Sie mit einer Mehrkanalpipette und filtrierten Pipettenspitzen 10 Mikroliter des Guanosinpentaphosphat-Gemischs mit dem Zelllysat für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Waschen Sie am Ende der Inkubation ein 96X-Stecknadelwerkzeug dreimal 30 Sekunden lang in einer 0,01%igen Lösung aus nichtionischem Reinigungsmittel, gefolgt von 30 Sekunden Trocknen auf einem Papiertuch pro Waschgang, bevor Sie das Stiftwerkzeug in die 96-Well-Probenplatte legen. Heben Sie das Stiftwerkzeug nach 30 Sekunden gerade nach oben und legen Sie es 30 Sekunden lang gerade nach unten auf eine Nitrozellulosemembran.

Legen Sie die Nitrozellulosemembran nach fünfminütiger Trocknung in die transparente Kunststoffmappe, um sie zu lagern, den Phosphorschirm zu belichten und durch Phosphorbildgebung sichtbar zu machen, wie gezeigt.

Um potenzielle Zielproteine in der Analysesoftware zu quantifizieren und zu identifizieren, die mit dem Phosphor-Imager verbunden ist, öffnen Sie die .gel-Datei der visualisierten Platten.

Um die zu analysierenden Spots zu definieren, verwenden Sie die Funktion "Array-Analyse", um ein 12-Spalten-mal-8-Zeilen-Raster einzurichten. Um den äußeren Rand der ganzen Flecken zu umschreiben, definieren Sie große Kreise. Exportieren Sie die "Volumen+Hintergrund" und "Fläche" der definierten großen Kreise in eine Tabelle, um die kleinen inneren Punkte zu umschreiben. Verkleinern Sie die definierten Kreise.

Exportieren Sie die "Volumen+Hintergrund" und "Fläche" der definierten kleinen Kreise und speichern Sie alle Daten in der Tabelle. Positionieren Sie Kreise so, dass sie sich bei Bedarf mit den Punkten überlappen, und passen Sie die Größe etwas größer als die tatsächlichen Punkte an.

Verwenden Sie die Gleichung, um die Bindungsbrüche in der Tabelle zu berechnen, und stellen Sie die Daten grafisch dar. Identifizieren Sie dann die potenziellen Bindungsproteine in den Wells, die im Vergleich zu den meisten anderen Wells hohe Bindungsfraktionen aufweisen.