Durchflusszytometrischer Assay zur Quantifizierung von oxidativem Stress: Ein Assay zur Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies in Darmorganoiden mit fluorogenen Sonden

Darmzellen produzieren reaktive Sauerstoffspezies - ROS. Moderate ROS-Spiegel halten die zelluläre Homöostase aufrecht, während hohe ROS-Spiegel zum Zelltod führen können.

Um die ROS-Spiegel in vitro zu quantifizieren, beginnen Sie mit einer Kultur von 3D-Organoiden aus dem Darm der Maus. Diese Organoide weisen eine Darm-Epithel-Architektur auf, die kryptenartige Ausstülpungen aufweist, in denen grüne Fluoreszenz-exprimierende Stammzellen untergebracht sind. Sie enthalten auch zottenartige differenzierte Zellen an der Peripherie, die das zentrale Lumen umgeben, das aus abgestorbenen Zellen und Trümmern besteht. Alle diese Zellen produzieren unterschiedliche Mengen an ROS.

Behandeln Sie nun die Organoide in den dafür vorgesehenen Vertiefungen mit ROS-Modulatoren. Aufgrund ihrer Beschaffenheit können Modulatoren als ROS-Induktoren oder -Inhibitoren wirken. Entfernen Sie nach der Inkubation für die erforderliche Dauer das verbrauchte Medium.

Fügen Sie der Kultur ein proteolytisches Enzym hinzu, das die 3D-Architektur der Organoide stört und verschiedene Zellen in Suspension freisetzt. Als nächstes fügen Sie eine ROS-empfindliche fluorogene Sonde hinzu und inkubieren.

Beim Eintritt in