JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 2:59 Min. • July 8th, 2025
Nukleäre fehlgefaltete Proteine, denen eine definierte Tertiärstruktur fehlt, werden mit kleinen Ubiquitin-ähnlichen Modifikatoren, SUMOs, und Ubiquitinmolekülen markiert, die ihren Abbau durch das proteolytische System, einschließlich des Ubiquitin-Proteasom-Systems, des UPS, erleichtern.
Bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen führt die UPS-Dysfunktion zur Akkumulation und Aggregation von nuklearen fehlgefalteten Proteinen, was zum neuronalen Tod führt.
Um die Abbaurate von nuklearen fehlgefalteten Proteinen in vitro zu untersuchen, wird eine Kultur adhärenter Säugetierzellen mit einer Mischung aus einer fluoreszenzmarkierten, fehlgefalteten Protein-kodierenden Plasmid-DNA und einem Transfektionsreagenz behandelt.
Erfolgreich transfizierte Zellen exprimieren fluoreszenzmarkierte fehlgefaltete Proteine mit kurzer Halbwertszeit, die mit einem nukleären Lokalisierungssignal markiert sind. Nach dem Transport in den Zellkern durchlaufen diese fehlgefalteten Proteine eine SUMOylierung und Ubiquitinierung und werden zur Proteinabbau und -clearance an das UPS übertragen.
Ersetzen Sie das Medium nach der Inkubation durch ein Medium mit niedriger Fluoreszenz, das Cycloheximid enthält.
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