JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 2:59 Min. • July 8th, 2025
Nukleäre fehlgefaltete Proteine, denen eine definierte Tertiärstruktur fehlt, werden mit kleinen Ubiquitin-ähnlichen Modifikatoren, SUMOs, und Ubiquitinmolekülen markiert, die ihren Abbau durch das proteolytische System, einschließlich des Ubiquitin-Proteasom-Systems, des UPS, erleichtern.
Bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen führt die UPS-Dysfunktion zur Akkumulation und Aggregation von nuklearen fehlgefalteten Proteinen, was zum neuronalen Tod führt.
Um die Abbaurate von nuklearen fehlgefalteten Proteinen in vitro zu untersuchen, wird eine Kultur adhärenter Säugetierzellen mit einer Mischung aus einer fluoreszenzmarkierten, fehlgefalteten Protein-kodierenden Plasmid-DNA und einem Transfektionsreagenz behandelt.
Erfolgreich transfizierte Zellen exprimieren fluoreszenzmarkierte fehlgefaltete Proteine mit kurzer Halbwertszeit, die mit einem nukleären Lokalisierungssignal markiert sind. Nach dem Transport in den Zellkern durchlaufen diese fehlgefalteten Proteine eine SUMOylierung und Ubiquitinierung und werden zur Proteinabbau und -clearance an das UPS übertragen.
Ersetzen Sie das Medium nach der Inkubation durch ein Medium mit niedriger Fluoreszenz, das Cycloheximid enthält. Cycloheximid, ein zellpermeables Molekül, bindet an die große ribosomale Einheit und blockiert die Elongationsphase der Proteintranslation und der weiteren Proteinsynthese, was die Untersuchung der Abbaurate der fluoreszenzmarkierten translatierten fehlgefalteten Proteine erleichtert.
Behandeln Sie eine Reihe von Vertiefungen mit einem Proteasom-Inhibitor, um die Proteasomaktivität zu blockieren und die anreicherung der fehlgefalteten Proteine zu bewirken. Messen Sie mit einem Mikroplatten-Reader die Fluoreszenz der fehlgefalteten Proteine.
Ein zeitabhängiger Abfall der Fluoreszenz deutet auf einen fehlgefalteten Proteinabbau hin. Zellen, die mit dem Proteasom-Inhibitor behandelt wurden, weisen im Laufe der Zeit eine ähnliche Fluoreszenzintensität auf, was auf die Hemmung des fehlgefalteten Proteinabbaus hinweist.
Nach der Aussaat und Transfektion der HeLa-Zellen in 96-Well-Platten gemäß dem Textprotokoll (20 bis 24 Stunden nach der Transfektion) untersuchen Sie die Zellen auf GFP-Expression. Entfernen Sie das Medium mit ca. 200 Mikrolitern 1x PBS in jede Vertiefung und saugen Sie es dann an, um das restliche DMEM zu entfernen.
Fügen Sie 60 Mikroliter DMEM mit niedriger Fluoreszenz mit 5 % FBS und 50 Mikrogramm pro Milliliter Cycloheximid hinzu und fügen Sie 10 mikromolare MG132 zu einem Probensatz hinzu.
Messen Sie mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät das GFP-Signal und lesen Sie die Platten stündlich für bis zu 8 bis 10 Stunden. Exportieren Sie die Daten und führen Sie statistische Analysen gemäß dem Textprotokoll durch.