Bioreporter-Assay: Eine empfindliche Technik mit einem biolumineszierenden Reportersystem zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern

Bei einer Infektion mit dem schweren akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 oder SARS-CoV-2 bindet die Rezeptorbindungsdomäne des Virus-Spike-Proteins, RBD, an das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) der Wirtszelle und erleichtert so den Eintritt viraler Zellen. Als Reaktion darauf produziert das Immunsystem Antikörper, die an die virale RBD binden und den Zelleintritt verhindern, wodurch die virale Infektiosität verringert wird.

Zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern, die auf RBD abzielen, wird eine rekombinante Bioreporter-Suspension verwendet, die aus kleinen Proteinfragmenten besteht, die mit SARS-CoV-2-Spike-RBD fusioniert sind. Fügen Sie standardmäßige RBD-gerichtete SARS-CoV-2-Antikörper und Antikörper-bindende Magnetbeads hinzu.

Während der Inkubation bindet die Fc-Antikörperregion an die Fc-Bindungsdomänen der Beads. Darüber hinaus bindet der rekombinante Bioreporter an die bead-gebundenen RBD-Antikörper, die auf SARS-CoV-2 abzielen.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Mischung. Den ungebundenen Bioreporter-haltigen Überstand entfernen. Suspendieren Sie die gebundenen Perlen wieder im Puffer. Auf eine Multi-Well-Platte umfüllen.

Fügen Sie eine Lösung hinzu, die große Proteinfragmente enthält, die eine hohe Affinität zu kleinen Proteinfragmenten aufweisen. Große und kleine Proteinfragmente binden sich an und bilden ein aktives, künstlich hergestelltes Luciferase-Enzym.

Fügen Sie Furimazin, ein Luciferase-Substrat, hinzu. Luciferase katalysiert die Oxidation von Furiamazin und verursacht Lichtemissionen. Messen Sie mit einem Luminometer die Lumineszenz, die auf das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern hinweist.

Hohe Signalintensitäten deuten auf hohe Konzentrationen von RBD-gerichteten SARS-CoV-2-Antikörpern hin.

Um den HiBiT-RBD-Antikörpernachweisassay durchzuführen, bereiten Sie den HiBiT-RBD-Bioreporter vor und kombinieren Sie 50 Mikroliter des HiBiT-RBD-haltigen Überstands mit 1 Mikrogramm des kommerziellen SARS-CoV-2-RBD-Antikörpers in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.

Geben Sie 20 Mikroliter Immunglobulin-bindendes Protein oder Protein G in die Lösung. Bringen Sie das Gesamtvolumen durch Zugabe von PBS auf 300 Mikroliter. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang auf einem Röhrchenschüttler oder Rotator, zentrifugieren Sie sie 30 Sekunden lang bei 12.000 x g, entsorgen Sie dann den Überstand und waschen Sie ihn mit PBS. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um die freie HiBiT-RBD zu entfernen.

Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern PBS und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-Platte. Fügen Sie 50 Mikroliter 1x LgBiT hinzu und warten Sie 5 Minuten. Fügen Sie dann 50 Mikroliter 1x NanoLuc Substrat hinzu. Lesen Sie das Lumineszenzsignal sofort mit einem Luminometer aus.