JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologische Techniken
0 Ansichten • 3:03 Min. • July 8th, 2025
Die zelluläre Proteinhomöostase oder Proteostase beinhaltet die Regulation der Proteinfaltung und -funktion sowie den Abbau fehlgefalteter Proteine. Während des Alterns nimmt die Proteostase-Maschinerie ab, was dazu führt, dass sich falsch gefaltete Proteine ansammeln und weiter aggregieren, was zu zellulären Funktionsstörungen führt.
Um den altersassoziierten Rückgang der Proteostase zu bestimmen, beginnen Sie mit entwicklungssynchronisierten, adulten transgenen Caenorhabditis elegans.
Die Muskelzellen dieser Würmer exprimieren Proteine mit abnormal expandiertem Polyglutamin oder PolyQ, Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Tag verschmolzen sind. PolyQ-Proteine neigen zur Fehlfaltung und können daher bei Akkumulation Aggregate bilden.
Die Würmer werden auf einen Objektträger mit einem Agarose-Pad übertragen und mit einer geeigneten Chemikalie für die Bildgebung lebender Zellen immobilisiert. Visualisieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop die Körperwandmuskulatur der Würmer über einen bestimmten Zeitraum, um die hellen, fluoreszierenden Foki-Signale zu bestimmen, die den fluoreszierenden polyQ-Aggregaten entsprechen.
Aufgrund des altersbedingten Rückgangs der Proteostase kommt es innerhalb weniger Tage zu einer progressiven Akkumulation von PolyQ-Aggregaten, was zu einer höheren Anzahl von Fluoreszenzherden führt. Die erhöhten polyQ-Aggregate in Muskelzellen verursachen Toxizität und stören die Funktion der Muskelzellen, was zu Lähmungen führt.
Erfassen Sie unter dem Mikroskop die Anzahl der lebenden, gelähmten Würmer, die sich aufgrund mechanischer Reize nicht bewegen. Eine erhöhte Wurmlähmungsrate deutet auf einen altersbedingten Rückgang der Proteostase im Muskelgewebe der Würmer hin.
Um den Rückgang der Proteostase im Muskelgewebe zu messen, wählen Sie 20 Tiere aus und montieren Sie sie auf einen Objektträger mit einem 3%igen Agarose-Pad und einem 5-Mikroliter-Tropfen 10-Millimolar-Natriumazid.
Nachdem alle Würmer immobilisiert sind, bilden Sie den gesamten Körper der Tiere mit einer 10-fachen Vergrößerungslinse ab. Verwenden Sie für jedes Tier einen FITC- oder YFP-Filter und die gleiche Belichtung. Wenn Sie fertig sind, verwerfen Sie die Folien.
Zählen Sie die Anzahl der Herde in der Körperwandmuskulatur des ganzen Tieres. Brennpunkte sind hellere, punktuelle Signale, die von dem schwächeren löslichen Signal im Hintergrund unterschieden werden können.
Schauen Sie sich an den Wertungstagen die Platten mit den Tieren an und notieren Sie die Anzahl der gelähmten Tiere. Nehmen Sie dann gelähmte Tiere von der Platte.
Berechnen Sie am Ende des Experiments die Lähmungsrate für jede Bedingung, und stellen Sie den Verlauf der Lähmung grafisch dar.