Bakterieller Co-Inkubations-Assay: Eine auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der intraspezifischen bakteriellen Konkurrenz auf Einzelzellebene

Die intraspezifische Konkurrenz zwischen zwei Bakterienstämmen führt dazu, dass der Inhibitorstamm toxische Effektormoleküle freisetzt, die die Zielpopulation töten.

Um kompetitive Wechselwirkungen zwischen zwei gramnegativen Bakterienstämmen sichtbar zu machen, beginnen Sie mit einer Co-Kultur, die einen Inhibitor und einen Zielstamm in gleichen Mengen enthält.

Beide Stämme sind so konstruiert, dass sie verschiedenfarbige fluoreszierende Proteine exprimieren, um sie während der Bildgebung visuell zu unterscheiden. Konzentrieren Sie die Kultur, um den Zell-zu-Zell-Kontakt zwischen den Bakterienstämmen zu maximieren. Platzieren Sie die Mischkultur auf einem Deckglas, das am Boden einer Schale platziert ist.

Legen Sie ein verfestigtes Agarose-Pad über die Stelle, damit sich die Bakterien immobilisieren können, und decken Sie es mit einem weiteren Deckglas ab. Inkubieren, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen und die Bedingungen des Bakteriengedränges zu simulieren.

Die Zellhülle des inhibitorischen Stammes enthält ein spezialisiertes Sekretionssystem - das Sekretionssystem vom Typ sechs oder T6SS. Es besteht aus einem Membrankomplex, einer Grundplatte und einem Innenrohr, das von einer kontraktilen Hülle umgeben ist.

Bei der Erkennung eines Kontakts aktiviert der Inhibitorstamm sein T6SS, was zu einer Kontraktion der Hülle und einer Ausstoßung des Schlauchs führt, was schließlich zur Perforation der bakteriellen Zielzellmembran führt. Dies erleichtert die Abgabe der Effektormoleküle an die Zielbakterien, was zu deren Tod führt.

Aufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop zur Identifizierung unterschiedlich fluoreszierender Bakterienstämme. Eine runde Morphologie der Zielbakterien und eine Verringerung ihrer Anzahl bestätigen die erfolgreiche Abtötung durch die Hemmbakterien.

Messen und erfassen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern für alle Proben. Normalisieren Sie jede Probe auf eine optische Dichte von 1, indem Sie die Kultur mit LBS-Medium verdünnen.

Mischen Sie die beiden konkurrierenden Stämme im gleichen Verhältnis, indem Sie 30 Mikroliter jedes normierten Stammes in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Röhrchen geben. Die gemischte Stammkultur 1 bis 2 Sekunden lang vortexen. Mischen Sie die konkurrierenden Stämme für jedes biologische Replikat und jede Behandlung, um insgesamt 4 Röhrchen mit gemischten Stämmen zu erhalten.

Jede Mischkultur wird durch Zentrifugieren dreifach konzentriert, um eine ausreichend dichte konkurrierende Zellen für die kontaktabhängige Abtötung während der Co-Inkubation zu gewährleisten. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie jedes Pellet und 20 Mikroliter LBS-Medium und führen Sie Konzentrationsverfahren für jede Probe durch.

Wenn Sie mit einem inversen Mikroskop fotografieren, beginnen Sie damit, zwei Mikroliter einer Mischkultur auf den Deckglasboden #1,5 einer 35-Millimeter-Petrischale zu sprühen und das Agarose-Pad über den Co-Inkubationsfleck zu legen. Legen Sie ein 12 Millimeter großes, kreisförmiges Deckglas über das Agarose-Pad. Wiederholen Sie die Fleckenbildung und das Anbringen des Deckglases für die verbleibenden 3 Mischkulturen, was dazu führt, dass 4 Schalen abgebildet werden.

Bevor Sie fortfahren, lassen Sie die Objektträger etwa 5 Minuten lang auf dem Labortisch liegen, damit sich die Zellen auf dem Agarpad absetzen können, um Bewegungen während des Bildgebungsprozesses zu vermeiden.

Beginnen Sie damit, sich auf Zellen zu konzentrieren, die DIC verwenden, um Photobleicheffekte zu minimieren. Basierend auf der durchschnittlichen Größe einer einzelnen Bakterienzelle verwenden Sie ein 100-faches Ölobjektiv. Passen Sie die Belichtungszeit und die Aufnahmeeinstellungen für jeden Kanal mit minimaler Hintergrunderkennung an. Wählen Sie mindestens 5 Sichtfelder aus und nehmen Sie Bilder in jedem entsprechenden Kanal auf.