Warum weist ein Signalverlust auf eine erfolgreiche Hemmung im Assay hin?

Signalverlust tritt auf, wenn inhibitorische Moleküle verhindern, dass Akzeptor- und Donorperlen sich annähern, wodurch der Transfer von Singulett-Sauerstoff und die Chemilumineszenz blockiert werden. Dies steht in direktem Zusammenhang mit der Störung der Ziel-Protein-Protein-Interaktion. Der Assay quantifiziert diesen Verlust als prozentuale Hemmung relativ zu Kontrollen.

Wie unterstützt die Isolierung der unabhängigen Variablen (Verbindungskonzentration) die Identifizierung von Wirkstoffen?

Durch die Testung serieller Verdünnungen jeder Verbindung im Dreifachansatz erzeugt der Assay Dosis-Wirkungs-Kurven, die die Konzentration der Verbindung als unabhängige Variable isolieren. Dies ermöglicht die Berechnung von IC50-Werten, um die Wirksamkeit innerhalb einer chemischen Substanzreihe zu bewerten. Der quantitative Vergleich von EC50- oder IC50-Werten unterstützt die Modellierung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen und den Übergang von Hits zu Leitstrukturen.

Welche quantitativen abhängigen Variablenmessungen ermöglichen die Auswahl von Hits?

Die abhängige Variable ist die chemilumineszente Signalintensität, gemessen als relative Lichtmengeneinheiten (RLU) mit einem Plattenlesegerät. Die % Hemmung wird aus den Signaldifferenzen zwischen Testansätzen und Kontrollen berechnet und liefert eine normalisierte Kenngröße zur Auswahl von Hits. Schwellenwerte wie eine Hemmung von 50 % bei 10 µM können angewendet werden, um Verbindungen für eine sekundäre Bestätigung zu priorisieren.

Warum sind Replikationsanforderungen wichtig für die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg?

Die Durchführung von Verbindungen im Dreifachansatz auf jeder Platte und die Wiederholung von Experimenten an verschiedenen Tagen gewährleisten die Zuverlässigkeit der Daten und verringern falsch-positive Ergebnisse aufgrund von Randeffekten der Mulden oder Variabilität der Reagenzien. Eine konsistente Reproduktion ermöglicht es Chemie-, Biologie- und Pharmakologieteams, die Ergebnisse zuverlässig zu interpretieren. Zudem unterstützt sie den Technologietransfer zwischen Standorten, indem sie eine reproduzierbare Testleistung etabliert.

Welche statistischen Analysefähigkeiten sind erforderlich, bevor dieser Assay durchgeführt wird?

Die Implementierung erfordert die Fähigkeit, den Z’-Faktor, das Signal-Rausch-Verhältnis und den Variationskoeffizienten aus Kontrollansätzen zu berechnen, um die Assay-Qualität zu bewerten. Die Daten müssen % Hemmungsberechnungen mit Konfidenzintervallen für die Trefferselektions-Schwellenwerte unterstützen. Es werden grundlegende Werkzeuge zur Kurvenanpassung für die Bestimmung des IC50 benötigt, um Bemühungen zur Optimierung von Leitverbindungen zu unterstützen.

Amplifizierter lumineszierender homogener Proximity-Assay: Ein bead-basierter Proximity-Assay zum Screening kleiner Moleküle, die Protein-Protein-Wechselwirkungen hemmen

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologische Techniken

0 Ansichten • 3:32 Min. • July 8th, 2025

In biologischen Systemen ist die Nähe eines Proteins zu seinem spezifischen Partner eine entscheidende Determinante für eine erfolgreiche Protein-Protein-Interaktion. Wenn kleine hemmende Moleküle vorhanden sind, können sich diese Proteine nicht nahe beieinander bewegen, was ihre Wechselwirkungen stört.

Um inhibitorische Moleküle auf störende Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen - einem Chaperon und einem Co-Chaperon - zu untersuchen, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte, die verschiedene kleine Moleküle enthält. Ergänzen Sie die Vertiefungen mit Spenderperlen, an deren Oberflächen Co-Chaperone befestigt sind. Diese Kügelchen enthalten Photosensibilisatoren für den Chemilumineszenz-Assay.

Fügen Sie eine Aufschlämmung von Akzeptorkügelchen hinzu, die an die vom Chaperon abgeleiteten Peptidsequenzen konjugiert sind, die spezifisch an das Co-Chaperon binden. Die Kügelchen enthalten einen Farbstoff auf Thioxenbasis und Fluorophore, die für die Visualisierung unerlässlich sind.

In Vertiefungen mit nicht-inhibitorischen Molekülen ziehen hohe Affinitäten zwischen den Chaperon-bindenden Peptiden und Co-Chaperonen die Akzeptor- und Donorkügelchen an. Während die Kügelchen entfernt bleiben, wenn Inhibitoren vorhanden sind.

Untersuchen Sie mit einem Chemilumineszenz-Reader die Wechselwirkung. Bei Beleuchtung bei einer bestimmten Wellenlänge emittieren die Photosensibilisatoren der Donorperlen hochreaktiven Singulett-Sauerstoff.

Da es keine inhibitorischen Moleküle gibt, gelangen die emittierten Spezies in die Nähe von proximal angeordneten Akzeptorkügelchen und reagieren mit Farbstoffmolekülen, was zu Chemilumineszenz führt. Diese Energie aktiviert die Fluorophore der Akzeptorkügelchen und verursacht eine Lichtemission.

Im Gegensatz dazu zerfallen Singulett-Sauerstoffe in den Vertiefungen mit inhibitorischen Molekülen, was zu einer Abwesenheit von Lichtemission führt, was auf eine erfolgreiche Hemmung der Protein-Protein-Wechselwirkungen hinweist.

Fügen Sie Glutathion-Donorkügelchen in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in PBS hinzu. GST-FKBP51 wird in eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter gegeben und die Reaktion 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln inkubiert.

Führen Sie serielle Verdünnungen der Testverbindung in DMSO durch. Geben Sie 0,25 Mikroliter Testverbindungsverdünnungen in dreifacher Ausfertigung in die Ecke jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte.

Für die Negativkontrolle fügen Sie 0,25 Mikroliter DMSO hinzu, und für die Positivkontrolle fügen Sie 0,25 Mikroliter Hsp90 C-terminales Peptid in die Vertiefungen hinzu.

Geben Sie 22,5 Mikroliter der Lösung, die Glutathion-Donorkügelchen mit GST-markierten Proteinen enthält, in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platte gründlich mit den Händen und inkubieren Sie sie im Dunkeln bei 25 Grad Celsius für 15 Minuten.

Ähnliche Videos

0 Aufrufe

Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026

Amplifizierter lumineszierender homogener Proximity-Assay: Ein bead-basierter Proximity-Assay zum Screening kleiner Moleküle, die Protein-Protein-Wechselwirkungen hemmen

Übersicht

Wesentliche Studienkomponenten

Bereich der Wissenschaft

Hintergrund

Zweck der Studie

Verwendete Methoden

Hauptergebnisse

Schlussfolgerungen

Häufig gestellte Fragen

Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie

Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung

Frühe Entdeckung und Zielvalidierung

Screening und Assay-Entwicklung

Translationale und präklinische Forschung

Pipeline- und Workflow-Integration

Operative und unternehmerische Auswirkungen

Durchführungsaspekte

Biopharma-Häufig gestellte Fragen

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Identifizieren von Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung mit einem Split Luciferase Assay System

Erforschung der biomolekularen Interaktion zwischen dem molekularen Chaperon Hsp90 und seiner Client-Proteinkinase Cdc37 unter Verwendung der Feldeffekt-Biosensortechnologie

In-vivo-Detektion von Protein-Protein-Interaktionen auf Micro-gemusterten Oberflächen

Proximity-Ligationsassay zur Untersuchung von In-situ-Protein-Wechselwirkungen

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay