Amplifizierter lumineszierender homogener Proximity-Assay: Ein bead-basierter Proximity-Assay zum Screening kleiner Moleküle, die Protein-Protein-Wechselwirkungen hemmen

In biologischen Systemen ist die Nähe eines Proteins zu seinem spezifischen Partner eine entscheidende Determinante für eine erfolgreiche Protein-Protein-Interaktion. Wenn kleine hemmende Moleküle vorhanden sind, können sich diese Proteine nicht nahe beieinander bewegen, was ihre Wechselwirkungen stört.

Um inhibitorische Moleküle auf störende Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen - einem Chaperon und einem Co-Chaperon - zu untersuchen, nehmen Sie eine Multi-Well-Platte, die verschiedene kleine Moleküle enthält. Ergänzen Sie die Vertiefungen mit Spenderperlen, an deren Oberflächen Co-Chaperone befestigt sind. Diese Kügelchen enthalten Photosensibilisatoren für den Chemilumineszenz-Assay.

Fügen Sie eine Aufschlämmung von Akzeptorkügelchen hinzu, die an die vom Chaperon abgeleiteten Peptidsequenzen konjugiert sind, die spezifisch an das Co-Chaperon binden. Die Kügelchen enthalten einen Farbstoff auf Thioxenbasis und Fluorophore, die für die Visualisierung unerlässlich sind.

In Vertiefungen mit nicht-inhibitorischen Molekülen ziehen hohe Affinitäten zwischen den Chaperon-bindenden Peptiden und Co-Chaperonen die Akzeptor- und Donorkügelchen an. Während die Kügelchen entfernt bleiben, wenn Inhibitoren vorhanden sind.

Untersuchen Sie mit einem Chemilumineszenz-Reader die Wechselwirkung. Bei Beleuchtung bei einer bestimmten Wellenlänge emittieren die Photosensibilisatoren der Donorperlen hochreaktiven Singulett-Sauerstoff.

Da es keine inhibitorischen Moleküle gibt, gelangen die emittierten Spezies in die Nähe von proximal angeordneten Akzeptorkügelchen und reagieren mit Farbstoffmolekülen, was zu Chemilumineszenz führt. Diese Energie aktiviert die Fluorophore der Akzeptorkügelchen und verursacht eine Lichtemission.

Im Gegensatz dazu zerfallen Singulett-Sauerstoffe in den Vertiefungen mit inhibitorischen Molekülen, was zu einer Abwesenheit von Lichtemission führt, was auf eine erfolgreiche Hemmung der Protein-Protein-Wechselwirkungen hinweist.

Fügen Sie Glutathion-Donorkügelchen in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in PBS hinzu. GST-FKBP51 wird in eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter gegeben und die Reaktion 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln inkubiert.

Führen Sie serielle Verdünnungen der Testverbindung in DMSO durch. Geben Sie 0,25 Mikroliter Testverbindungsverdünnungen in dreifacher Ausfertigung in die Ecke jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte.

Für die Negativkontrolle fügen Sie 0,25 Mikroliter DMSO hinzu, und für die Positivkontrolle fügen Sie 0,25 Mikroliter Hsp90 C-terminales Peptid in die Vertiefungen hinzu.

Geben Sie 22,5 Mikroliter der Lösung, die Glutathion-Donorkügelchen mit GST-markierten Proteinen enthält, in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platte gründlich mit den Händen und inkubieren Sie sie im Dunkeln bei 25 Grad Celsius für 15 Minuten.

Verdünnen Sie die Akzeptorkügelchen mit dem angehängten Hsp90 C-terminalen Peptid auf eine Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter in 0,5x PBS. Geben Sie 2,25 Mikroliter verdünnte Akzeptorkügelchen in jede Vertiefung. Schütteln Sie die Platte und inkubieren Sie sie wie gezeigt 15 Minuten lang im Dunkeln.

Schalten Sie das Plattenlesegerät ein, messen Sie das Signal der Platte und analysieren Sie die Daten, wie im Textmanuskript beschrieben.