Virus Plaque Assay: Eine Technik zur Messung des infektiösen Herpes-simplex-Virus durch Quantifizierung von Plaques, die in Monolayern von virusinfizierten Zellen gebildet werden

Bereiten Sie zunächst serielle Verdünnungen des Herpes-simplex-Virus, eines behüllten infektiösen Virus, in Puffer vor.

Besorgen Sie sich eine Multi-Well-Platte, die eine Monoschicht aus virusanfälliger Epithelzellkultur enthält. Ersetzen Sie ein bestimmtes Medienvolumen durch verdünnte Virussuspensionen, um eine gleichmäßige Monolayer-Abdeckung zu gewährleisten. Lassen Sie das Virus an der Zelloberfläche adsorbieren.

Entfernen Sie alle nicht adsorbierten Viren. Decken Sie die Zellmonoschicht mit methylcellulosehaltigen Medien ab und bilden Sie eine halbfeste Überlagerung.

Bei der Inkubation verschmelzen die Virushülle und die Zellmembran und geben das virale Nukleokapsid, das das doppelsträngige Genom umschließt, in das Zytoplasma ab. Darüber hinaus wird das virale Genom in den Zellkern freigesetzt.

Unter Verwendung der zellulären Maschinerie und des Virionproteins des Wirts exprimiert das virale Genom unmittelbar frühe virale Proteine, die die Expression früher Gene regulieren. Frühe virale Proteine vermitteln die virale DNA-Replikation.

Dann exprimieren späte virale Gene Strukturproteine, die sich zusammen mit dem viralen Genom zusammensetzen, um Virionpartikel der Nachkommen zu produzieren. Die virusinfizierten Zellen lysieren und setzen Virionen frei.

Methylcellulose schränkt die Virusbewegung ein, was dazu führt, dass Virionen nur die benachbarten Zellen infizieren und anschließend lysieren, wodurch Löcher in der Monoschicht entstehen.

Entfernen Sie nach der Inkubation die Methylcellulose-Überlagerung. Ethanolische Kristallviolettlösung hinzufügen. Ethanol fixiert Zellen und inaktiviert Viren, während Kristallviolett die Zellen färbt. Infolgedessen entstehen klare lysierte Zonen oder Plaques auf der Purpurzell-Monoschicht.

Zählen Sie die Plaques in jeder Vertiefung bei jeder Virusverdünnung, um den titer oder die Konzentration des infektiösen Virus zu bestimmen.

Entnehmen Sie das Zellkulturmedium mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen. Geben Sie die verdünnte Virusprobe vorsichtig tropfenweise in jede Monoschicht der Zellen, tropfenweise durch die Seite jeder Vertiefung.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle ein oder zwei Vertiefungen, bis die gesamte Platte mit den zu plaquenden Virusproben gefüllt ist. Den gesamten Teller vorsichtig mit der Hand rocken.

Inkubieren Sie die Platte dann 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius, damit das Virus adsorbiert werden kann. Nehmen Sie alle 10 Minuten die Platte aus dem Inkubator, schütteln Sie sie erneut vorsichtig, um das Virus gleichmäßiger über die einzelnen Vertiefungen zu verteilen, und legen Sie sie dann wieder in den Inkubator.

Um die Möglichkeit zu verringern, dass versehentlich nicht absorbiertes Inokulum gezählt wird, entnehmen Sie die Virusprobe mit einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze aus den Vertiefungen und entsorgen Sie die Probe in einem Abfallbecherglas.

Legen Sie 2,5 Milliliter einer Methylcellulose-Auflage auf die Platte und legen Sie sie wieder in den Inkubator. Desinfizieren Sie das Abfallbecherglas, in der Regel mit Zusatz von Bleichmittel, einem Jodophor oder einem ähnlichen Viruzid, bevor Sie es aus der Biosicherheitswerkbank nehmen.

Nach der zweitägigen Inkubation wird die Methylcellulose-Auflage mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen entfernt und in ein Abfallbecherglas gegeben. Geben Sie etwa 2 Milliliter 1 % Kristallviolett und 50 % Ethanol in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte mit allen Vertiefungen, die mit dem Fleck gefüllt sind, 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Desinfizieren Sie

an dieser Stelle den Abfallbecher, wie zuvor gezeigt. Waschen Sie die Teller kräftig mit Leitungswasser, bis der Abfluss klar ist.

Stellen Sie sicher, dass es etwa 10-fache Unterschiede in der Anzahl der Plaques in jeder Verdünnungsreihe gibt.